制备抗原探针
生成用于检测SARS-CoV-2刺突蛋白特异性B细胞的荧光标记抗原探针。
将生物素化的刺突蛋白亚基S1、S2和RBD与荧光标记的链霉亲和素按1:4的摩尔比混合，在4°C孵育60分钟。
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流式细胞术方案：表征针对SARS-CoV-2刺突蛋白抗原的人记忆B细胞
Flow cytometric protocol to characterize human memory B cells directed against SARS-CoV-2 spike protein antigens.
实验完整度
中方案提供了详细的染色、采集和设门步骤，并展示了四名供体的示例结果，但缺少机制验证或功能验证。
主要模型
冷冻保存的人外周血单个核细胞 SARS-CoV-2疫苗免疫的健康供体
重点核对
使用抗CD3、CD14、CD56抗体排除T细胞、单核细胞和NK细胞，CD19和/或CD20鉴定B细胞 用荧光标记的链霉亲和素和生物素化刺突蛋白制备抗原探针（S1、S2、RBD） 双重抗原探针（S1、S2）或单一探针（RBD）用于鉴定抗原特异性B细胞，并以链霉亲和素诱饵探针排除非特异性结合 使用LIVE/DEAD™可固定蓝死细胞染色试剂盒排除死细胞 在5激光Cytek Aurora光谱流式细胞仪上采集，使用单染参照对照进行光谱拆分
摘要
记忆B细胞（MBCs）作为感染或疫苗接种引发的免疫应答的一部分，可在淋巴器官和外周血中持续存在，并在再次接触抗原时能够快速再激活。在此，我们描述了一种流式细胞术检测方法，用于从外周血单个核细胞中鉴定抗原特异性MBCs，并表征其同型和活化状态。我们详细介绍了使用来源于SARS-CoV-2刺突蛋白的荧光标记抗原探针的步骤。这些探针可适用于检测针对其他抗原的MBCs。关于该方案的使用和执行的完整细节，请参阅Weskamm等人（2022）的文章。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过流式细胞术从人外周血单个核细胞中鉴定并表征SARS-CoV-2刺突蛋白特异性记忆B细胞？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过荧光标记的抗原探针结合链霉亲和素，鉴定S1、S2和RBD特异性记忆B细胞，并基于CD21、CD27和CD71等标志物分析同型和活化状态。示例结果显示，疫苗接种后S1特异性IgG+记忆B细胞频率为0.22%-4.82%。
- 研究意义
- 该方案可适应于检测针对其他抗原的记忆B细胞，有助于理解疫苗和感染诱导的免疫应答。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
解冻冷冻保存的PBMCs
获得用于流式染色的有活力的外周血单个核细胞。
在37°C水浴中快速解冻冷冻保存的PBMCs，用冷染色缓冲液洗涤并计数。
细胞染色与固定
通过三步染色和固定，标记死细胞、抗原特异性B细胞及表面标志物。
首先用LIVE/DEAD™可固定蓝死细胞染色试剂盒和FcR阻断试剂孵育；然后加入抗原探针和链霉亲和素诱饵探针进行抗原特异性染色；随后加入抗体混合物进行表面标志物染色；最后用4%多聚甲醛固定。
制备单染参照对照
为光谱流式细胞仪的光谱拆分提供每个荧光素的参照光谱。
使用杀死的PBMCs（热激）和补偿微球（UltraComp eBeads）制备单染对照，包括抗体单染和抗原探针单染。
在Cytek Aurora上采集样本
获得用于后续流式数据分析的原始数据文件。
启动Cytek Aurora，运行QC，设置实验，采集参照对照和样本，导出未混合的fcs文件。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞染色 | LIVE/DEAD™可固定蓝死细胞染色试剂盒 | Thermo Fisher | L23105 |
| FcR阻断试剂 | Miltenyi Biotec | 130-059-901 | |
| 抗原探针制备 | SARS-CoV-2刺突S1-His重组蛋白，生物素化 | Sino Biological | 40591-V08H-B |
| SARS-CoV-2刺突S2 ECD-His重组蛋白，生物素化 | Sino Biological | 40590-V08B-B | |
| SARS-CoV刺突/RBD蛋白（RBD，His标签），生物素化 | Sino Biological | 40150-V08B2-B | |
| PE-Cy5.5链霉亲和素 | Thermo Fisher | SA1018 | |
| AF647链霉亲和素 | Biolegend | 405237 | |
| PE-Cy7链霉亲和素 | Biolegend | 405206 | |
| PE链霉亲和素 | Biolegend | 405203 | |
| BV711链霉亲和素 | Biolegend | 405241 | |
| BV421链霉亲和素 | Biolegend | 405225 | |
| BIO200 - BIO-200生物素溶液 | Avidity | BIO200 | |
| 细胞染色 | Brilliant染色缓冲液 | BD | 566349 |
| 单染对照制备 | UltraComp eBeads™补偿微球 | Thermo Fisher | 01-2222-41 |
| 采集 | SpectroFlo® QC微球 | Cytek Biosciences | SKU |
| 流式采集 | Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek Biosciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 制备抗原探针 | 链霉亲和素与抗原的摩尔比（1:4），各抗原用量（S1: 90 ng，S2: 75 ng，RBD: 33 ng），孵育时间（60分钟）和温度（4°C） 阅读提示：步骤1-3，Table 1 |
| 解冻PBMCs | PBMCs数量（5-10百万），解冻温度（37°C水浴），洗涤条件（600g，8分钟，4°C） 阅读提示：步骤4-7 |
| 细胞染色 | 染色混合液1、2、3的组成及体积，孵育时间（15分钟、60分钟、30分钟）和温度（4°C），固定条件（4% PFA，15分钟，20-25°C） 阅读提示：步骤8-17，Table 2 |
| 单染对照制备 | 杀死PBMCs条件（65°C，10分钟），补偿微球使用，单染抗体及抗原探针的用量（PBMCs 2.5 μL，微球 1 μL） 阅读提示：步骤18-27，Table 3 |
| 采集 | Cytek Aurora启动和QC条件，激光预热时间（>45分钟），QC微球（SpectroFlo® QC Beads），采集阈值（1,000,000事件） 阅读提示：步骤28-31 |