筛选cGAS相互作用E3连接酶
鉴定与cGAS相互作用的E3连接酶，以寻找调控cGAS修饰和功能的因子。
使用酵母双杂交筛选，以pGBT9-cGAS为诱饵，筛选约200个pGADT7-E3构建体，鉴定出ARIH1作为cGAS相互作用蛋白。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
E3泛素连接酶ARIH1通过诱导cGAS的单ISG化修饰和寡聚化促进抗病毒免疫和自身免疫
The E3 ubiquitin ligase ARIH1 promotes antiviral immunity and autoimmunity by inducing mono-ISGylation and oligomerization of cGAS.
实验完整度
高研究包含体外细胞实验（HEK293、THP-1、BMDCs等）、体内动物模型（Cre-ER;Arih1fl/fl和Lyz2-Cre;Arih1fl/fl小鼠、Trex1−/−小鼠）以及机制验证（ISGylation、寡聚化、点突变等），具有多层级证据。
主要模型
HEK293细胞 THP-1细胞 小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDCs） Cre-ER;Arih1fl/fl和Lyz2-Cre;Arih1fl/fl小鼠
重点核对
细胞系：HEK293、THP-1、BMDCs、MLFs、cGas−/− MEFs HSV-1感染复数（MOI）和感染时间：如MOI=0.5，感染时间0-8小时 DNA转染剂量：如ISD45、HSV60、DNA90等1μg 小鼠模型：Cre-ER;Arih1fl/fl、Lyz2-Cre;Arih1fl/fl、Trex1−/−小鼠，HSV-1感染剂量（1×10^7 PFU腹腔或1×10^6 PFU颅内） 关键分子：cGAS K187（人）和K173（鼠）位点的ISGylation
摘要
胞质DNA传感器环状GMP-AMP合酶（cGAS）在抗病毒免疫和自身免疫中发挥关键作用。cGAS的活性和稳定性通过翻译后修饰精细调控。在这里，我们显示ariadne RBR E3泛素蛋白连接酶1（ARIH1）催化cGAS的单ISG化修饰并诱导其寡聚化，从而促进抗病毒免疫和自身免疫。敲低或敲除ARIH1显著抑制单纯疱疹病毒1型（HSV-1）或胞质DNA诱导的I型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的表达。一致地，他莫昔芬处理的ER-Cre;Arih1fl/fl小鼠和Lyz2-Cre;Arih1fl/fl小鼠与对照相比对HSV-1感染高度敏感。此外，在髓系细胞中缺失ARIH1减轻自身免疫表型，并完全挽救由TREX1缺陷引起的自身免疫致死性。机制上，HSV-1或胞质DNA诱导的cGAS寡聚化和激活通过其K187残基的ISG化修饰增强，该修饰由ARIH1催化。我们的发现揭示了ARIH1在先天抗病毒和自身免疫反应中的重要作用，并为cGAS的翻译后调控提供了见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ARIH1如何调控cGAS的翻译后修饰及其在抗病毒免疫和自身免疫中的作用？
- 核心机制
- ARIH1催化cGAS在K187（人）或K173（鼠）位点发生单ISG化修饰，解除该位点对cGAS寡聚化的抑制，增强cGAS寡聚化和激活，促进I型干扰素和促炎细胞因子表达。
- 主要证据
- 通过酵母双杂交筛选发现ARIH1与cGAS相互作用；敲低/敲除ARIH1减弱HSV-1和DNA诱导的免疫反应；体内小鼠对HSV-1感染敏感性增加；ARIH1催化cGAS单ISG化，K187突变增强cGAS寡聚化和活性。
- 研究意义
- 揭示cGAS激活的新调控机制，为病毒感染相关疾病和自身免疫病提供潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证ARIH1与cGAS的相互作用
确认ARIH1与cGAS的特异性结合，并确定相互作用的结构域。
通过共免疫沉淀（co-IP）验证外源和內源相互作用，GST pull-down验证直接相互作用，并通过截短突变体进行结构域定位。
敲低/敲除ARIH1对细胞抗病毒反应的影响
评估ARIH1在HSV-1和胞质DNA触发的先天免疫信号通路中的作用。
在THP-1细胞中敲低ARIH1，检测HSV-1或DNA转染诱导的ISG表达和IRF3/TBK1/p65磷酸化；在BMDCs中敲除ARIH1，检测细胞因子表达和HSV-1复制。
敲除ARIH1对小鼠HSV-1感染敏感性的影响
评价ARIH1在体内抗病毒免疫中的作用。
使用他莫昔芬诱导的Cre-ER;Arih1fl/fl和Lyz2-Cre;Arih1fl/fl小鼠，腹腔或颅内感染HSV-1，监测存活率、细胞因子产生、病毒载量和组织病理。
验证ARIH1的酶活性对抗病毒信号的重要性
确定ARIH1的E3连接酶活性是否是其促进抗病毒免疫所必需的。
在ARIH1缺陷细胞中回补野生型ARIH1或催化失活突变体ARIH1C357S，检测抗病毒反应。
检测ARIH1对cGAMP产生和cGAS寡聚化的影响
揭示ARIH1作用机制是否在cGAS水平影响cGAMP产生和寡聚化。
利用cGAMP活性测定评估ARIH1缺陷细胞中DNA转染后cGAMP产生；通过SDD-AGE分析HSV-1感染后cGAS寡聚化。
敲除ARIH1对Trex1−/−小鼠自身免疫的影响
评估ARIH1在自身DNA触发的自身免疫中的作用。
在Trex1−/−背景下髓系敲除ARIH1，观察自身免疫表型是否减轻或挽救致死性。
验证ARIH1催化cGAS的单ISG化修饰
确定ARIH1是否作为E3连接酶催化cGAS的ISGylation，并鉴定修饰位点。
在HEK293细胞中过表达ARIH1和ISG化系统组分，检测cGAS的ISGylation；体外ISG化实验确认直接催化；通过LC-MS鉴定修饰位点并验证突变。
鉴定cGAS ISG化的关键赖氨酸残基及其功能
确定cGAS上ISG化位点对抗病毒反应的影响。
通过LC-MS鉴定cGAS ISG化位点为K187，构建突变体，在细胞和体外实验中验证其对cGAS激活和寡聚化的影响。
探究K187位点对cGAS寡聚化和活化的抑制作用
理解ISG化修饰如何通过调节K187影响cGAS功能。
比较野生型cGAS与K187突变体（R、S、D、G、F）在DNA刺激下的寡聚化和活性，确认K187抑制cGAS激活，而ISG化解除此抑制。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子相互作用
验证基因表达和蛋白水平
验证细胞功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 500-P65 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 500-P62G | |
| I型胶原酶 | Worthington | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Sigma-Aldrich | -- | |
| 药物处理 | 他莫昔芬 | Sigma | T5648 |
| 4-羟基他莫昔芬 | Sigma | H6278 | |
| 信号转导研究 | MLN4924 | MedChemExpress | HY-70062 |
| 转染 | PEI转染试剂 | Polysciences Inc | 24765-1 |
| 蛋白质纯化 | 谷胱甘肽-琼脂糖基质 | Transgen Biotech | -- |
| Ni-NTA琼脂糖 | QIAGEN | -- | |
| 蛋白质表达 | TNT快速偶联转录/翻译系统试剂盒 | Promega | -- |
| RNA提取和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| All-in-One cDNA合成SuperMix | Aidlab Biotechnologies | -- | |
| SYBR Green快速qPCR预混液 | Yeasen Biotechnology | -- | |
| ELISA | IFN-β ELISA试剂盒 | Biolegend | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| TNF ELISA试剂盒 | Biolegend | -- | |
| CCL5 ELISA试剂盒 | 4A Biotech | -- | |
| 蛋白纯化（体外ISG化） | UBE1L蛋白 | Sino Biological | 11990-H20B |
| UBCH8蛋白 | Enzo Life Sciences | BML-UW9135 | |
| PCR和免疫染色 | Phusion聚合酶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | 细胞类型：HEK293、THP-1、BMDCs、MLFs、cGas−/− MEFs、L929和HFF细胞；需确认来源和培养条件。 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 动物模型 | 小鼠品系：Cre-ER;Arih1fl/fl和Lyz2-Cre;Arih1fl/fl；他莫昔芬注射剂量和方案（80mg/kg，连续5天）；HSV-1感染途径和剂量（腹腔1×10^7 PFU，颅内1×10^6 PFU）。 阅读提示：Methods: Mice, Tamoxifen-mediated deletion, Viral infection |
| 病毒和转染 | HSV-1毒株（H129-G4或野生型），MOI和感染时间；dsDNA配体（ISD45, HSV60, DNA90）浓度（1μg）；转染试剂PEI使用比例。 阅读提示：Methods: Transfection of DNA ligands, poly(I:C) and cGAMP, Viral infection |
| 蛋白修饰检测 | ISGylation检测需共转染UBE1L、UBCH8、ISG15和ARIH1；变性IP洗涤缓冲液成分；体外ISG化反应条件（各组分浓度，37°C 2小时）。 阅读提示：Methods: Denature-IP and ISGylation assays, In vitro ISGylation assay |
| cGAS寡聚化检测 | SDD-AGE凝胶浓度和电泳条件（2%琼脂糖，100V，4°C）；体外DNA结合实验使用ISD45（2μM），孵育条件。 阅读提示：Methods: SDD-AGE, Analysis of in vitro oligomerization of cGAS |
| 敲除验证 | Arih1fl/+小鼠构建使用CRISPR/Cas9，loxP位点位于第3外显子；Cre品系：Lyz2-Cre、Cre-ER、Trex1+/−；基因分型引物序列。 阅读提示：Methods: Mice, Tamoxifen-mediated deletion |