神经干细胞模型的建立与分化表征
建立iPSC来源的NSC模型并验证其干性和分化能力。
使用iPSC来源的NSC系（Ctrl#1和Ctrl#2），在EGF/FGF2存在下扩增，撤除FGF2诱导分化，通过免疫染色检测Sox2、Nestin、Tubb3、HuC/D，并在第3、5、7天定量神经元比例。
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人类神经干细胞中有丝分裂期间溶酶体的差异遗传导致不对称的Notch活性。
Asymmetric Notch activity by differential inheritance of lysosomes in human neural stem cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验、类器官模型、多色免疫荧光、活细胞成像、CRISPR报告系、Western blot、qPCR和梯度离心等，并进行功能与机制验证。
主要模型
人类iPSC来源的神经干细胞（NSCs） 人类前脑类器官（forebrain organoids）
重点核对
NSCs在FGF2撤除后第3天用于不对称分裂分析 使用dynasore抑制dynamin确认Notch内吞机制 DAPT和BafA处理验证γ-分泌酶和溶酶体酸化对Notch激活的必要性 HES1报告细胞系追踪Notch活性 类器官中平面、中间和分层分裂的LAMP1和Notch1不对称定量
摘要
对称和不对称细胞分裂是干细胞扩增和产生更定向后代的保守策略。在这里，我们证明了在人类神经干细胞（NSCs）中，溶酶体在有丝分裂期间不对称遗传。我们表明溶酶体含有Notch受体，并且Notch激活发生在酸性溶酶体环境中。溶酶体不对称性与Notch靶基因HES1的表达和子细胞中Notch信号活性相关。此外，在人类大脑发育的类器官模型中也观察到溶酶体和Notch受体的不对称性，有丝分裂图形显示溶酶体和Notch受体优先遗传给保持与顶端膜相连的子细胞。因此，这项研究提示了溶酶体作为信号枢纽的一种先前未知的功能，在人类NSC不对称细胞分裂后，在子细胞之间建立Notch信号活性的偏差。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类神经干细胞分裂时，溶酶体是否不对称遗传并通过影响Notch信号来决定子细胞命运？
- 核心机制
- 配体结合的Notch受体通过网格蛋白和发动蛋白介导的内吞作用进入溶酶体，在酸性环境中经γ-分泌酶切割激活，溶酶体的不对称遗传导致Notch信号活性在子细胞间产生偏差。
- 主要证据
- 免疫荧光显示LAMP1和Notch1不对称共分离；蔗糖梯度离心显示Notch1与LAMP1共分布；dynasore阻断内吞；BafA抑制酸化减少N1ICD和HES1表达；HES1报告细胞显示溶酶体不对称分裂时HES1表达偏差；脑类器官中分层分裂时顶端子细胞获得更多LAMP1和Notch1。
- 研究意义
- 该研究提示溶酶体作为信号枢纽在人类神经干细胞不对称分裂中建立Notch信号偏差，可能影响子细胞命运决定，并为神经发育和干细胞生物学提供新视角。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
有丝分裂中囊泡不对称分配分析
鉴定哪些内溶酶体囊泡在有丝分裂中不对称分离。
通过免疫荧光染色标记EEA1、Rab5、Rab7、Rab11、Sara、LC3、LAMP1、LAMP2、CD63，量化有丝分裂末期子细胞中的信号强度，计算不对称指数A。
Notch受体在溶酶体中的定位和转运机制
验证Notch1受体存在于溶酶体并研究其内吞和运输途径。
蔗糖梯度离心分离亚细胞组分，Western blot检测Notch1、LAMP1、CD63、Sara、EEA1、Presenilin1；用dynasore处理细胞观察共定位变化；免疫染色检测N1ECD与网格蛋白或CTB的共定位。
配体结合Notch内化至溶酶体的检测
确认配体结合促进Notch内吞并转运至酸性溶酶体。
使用pHrodo标记的DLL1（pHrodo-DLL1）进行内化实验，活细胞成像观察pHrodo信号随时间变化，并与LysoTracker共定位；免疫染色检测DLL1-6xHis与Notch1和LAMP1的共定位。
Notch激活依赖溶酶体酸化验证
探究溶酶体酸化对Notch切割和信号激活的必要性。
用DAPT、BafA、Leu处理NSCs 2小时，Western blot检测N1ICD和总Notch1水平，qPCR检测HES1、HES5、HEY1表达。
HES1报告细胞系的建立和验证
生成能够实时追踪Notch活性的报告细胞系。
通过CRISPR-Cas9在HES1基因座敲入tdTomato-T2A-NLS-PEST，筛选克隆，验证多能性标志物表达，并通过DAPT和BafA处理检测报告信号变化。
溶酶体不对称与Notch活性关联分析
直接评估溶酶体不对称遗传对子细胞Notch活性的影响。
使用HES1报告NSCs，LysoTracker染色标记溶酶体，活细胞成像跟踪有丝分裂事件，量化溶酶体分布和tdTomato荧光在子细胞中的动态变化，并进行聚类分析。
脑类器官中不对称分裂验证
在更具生理性的模型中验证溶酶体和Notch的不对称分配。
生成前脑类器官，第20天固定切片，免疫染色检测LAMP1和Notch1，通过phalloidin和DAPI识别有丝分裂细胞，分类为平面、中间、分层分裂，定量不对称指数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Geltrex基底膜基质 | Invitrogen | A1413302 |
| DMEM/F12培养基 | Invitrogen | 11320074 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 成纤维细胞生长因子2 | Cell Guidance Systems | GFH146 | |
| 表皮生长因子 | Cell Guidance Systems | GFH26 | |
| Y-27632 | Cell Guidance Systems | SM02 | |
| 药物处理 | DAPT | Cell Guidance Systems | SM15 |
| 巴弗洛霉素A1 | VWR International | J61835.MX | |
| 亮抑酶肽 | SERVA Electrophoresis GmbH | 51867.02 | |
| Dynasore | -- | -- | |
| 免疫荧光染色 | LAMP1抗体（H4A3） | DSHB | H4A3 |
| CD63抗体 | ExBio Praha | 11-343-C100 | |
| Notch1抗体（4380） | Cell Signaling Technology | 4380 | |
| Notch1胞外域抗体 | BioLegend | 819101 | |
| 鬼笔环肽-ATTO 565 | Atto Tec AD | 565-81 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 重组蛋白 | DLL1-6xHis重组蛋白 | R&D Systems | 1818-DL-050 |
| DLL1-6xHis重组蛋白 | Sino Biological | 11635-H08H | |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 硝酸纤维素膜 | Bio-Rad | -- | |
| qPCR | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891BUN |
| GoTaq DNA聚合酶 | Promega | M780B | |
| 显微镜 | Leica DM6 B显微镜 | Leica | -- |
| TCS SP5 II共聚焦显微镜 | Leica | -- | |
| Celldiscoverer 7显微镜 | Carl Zeiss | -- | |
| Odyssey成像系统 | Li-COR | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 神经干细胞培养 | 细胞系：Ctrl#1和Ctrl#2；培养条件：EGF/FGF2存在；基质：Geltrex包被；培养基：DMEM/F12补充N2、B27、葡萄糖。 阅读提示：Methods: 一般细胞培养、iPSCs培养、神经诱导和NSC培养 |
| FGF2撤除分化 | 时间点：第3天用于不对称分析；分化时间：1周；神经元定量：HuC/D+细胞比例。 阅读提示：Results: 第一段；Fig. 1（B, C）图注 |
| 免疫荧光染色 | 固定：4% PFA 10分钟；透化：0.1%皂苷或0.3% Triton X-100；一抗孵育：4℃过夜；二抗：室温1小时；核染色：DAPI。 阅读提示：Methods: 免疫荧光染色 |
| 不称量分析 | 不对称指数A阈值：>0.2；细胞分裂期：末期；成像：z-stack步长0.29 μm（2D）或0.5 μm（3D）；ROI基于DAPI和phalloidin。 阅读提示：Methods: 不对称性定量；Fig. 1（D-G）图注 |
| 配体内化实验 | DLL1-pHrodo使用：50 μg蛋白标记；处理浓度：0.1 nM LysoTracker Deep Red，50 μM dynasore；成像：37°C, 5% CO2；时间：30分钟至1小时。 阅读提示：Methods: 配体内化 |
| 药物处理 | DAPT浓度：20 μM；BafA浓度：100 nM；Leu浓度：200 μM；DMSO浓度：0.1%；处理时间：2小时；检测：Western blot、qPCR。 阅读提示：Results: 第三部分；Methods: Western blot、实时PCR和qPCR |
| HES1报告实验 | 报告细胞系：Ctrl#2-iPSC来源；混合比例：1:10报告:野生型；同步化：75 nM nocodazol处理4小时；LysoTracker浓度：0.1 nM；成像时间：分裂后1.5至6小时。 阅读提示：Methods: 追踪有丝分裂事件和相应子细胞 |
| 脑类器官实验 | 类器官时间：第20天；切片厚度：20 μm；分类：平面、中间、分层；分析：LAMP1和Notch1不对称指数。 阅读提示：Methods: 皮质前脑型类器官生成；Results: 第六部分；Fig. 6（C-E）图注 |