发现CD1a特异性γδ T细胞
确定人类外周血中是否存在CD1a反应性γδ T细胞。
从健康供者PBMC中通过流式分选获得CD1a-endo四聚体阳性γδ T细胞，并克隆其TCR序列。
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自反应γδ T细胞受体对CD1a的非典型侧向识别
Atypical sideways recognition of CD1a by autoreactive γδ T cell receptors.
实验完整度
高包含体外T细胞筛选、SPR亲和力测量、X射线晶体学结构解析以及基于支持脂质双层的信号传导功能验证等多个独立证据层级。
主要模型
HEK293T细胞 Jurkat76 T细胞系 K562细胞 支持脂质双层
重点核对
CD1a-endo四聚体染色筛选γδ T细胞 CO3和CO22 TCR的Vγ和Vδ链使用 SPR测量的γδ TCR与CD1a变体的结合亲和力 CO3 γδ TCR-CD1a复合物的晶体结构 CD1a诱导的TCR聚集和CD3ζ磷酸化
摘要
CD1a是树突状细胞上的单态抗原呈递分子，向αβ T细胞呈递脂质。CD1a是否代表其他免疫受体的配体尚不清楚。在这里，我们使用CD1a四聚体证明CD1a是Vδ1+ γδ T细胞的配体。功能研究表明，两种γδ T细胞受体（TCR）以脂质非依赖方式结合CD1a。三个Vγ4Vδ1 TCR-CD1a-脂质复合物的晶体结构揭示，γδ TCR结合在CD1a抗原结合裂隙β折叠片层长轴的极远侧并与其平行。在这里，γδ TCR共同识别CD1a重链和β2微球蛋白，这种方式不同于所有先前观察到的γδ TCR对接模式。自反应CD1a识别的“侧向”和脂质抗原非依赖模式诱导细胞表面TCR聚集和近端T细胞信号传导，如通过CD3ζ磷酸化所测量的。与通常接触所携带抗原的αβ TCR的“端到端”结合相比，自反应γδ TCR支持对CD1a的几何多样性接近方式以及抗原非依赖识别。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- CD1a是否作为γδ T细胞受体的配体，以及γδ TCR如何以非典型方式识别CD1a。
- 核心机制
- γδ TCR以侧向方式结合CD1a，接触其重链和β2微球蛋白，不依赖于脂质抗原，诱导TCR聚集和近端信号传导。
- 主要证据
- CD1a四聚体染色、SPR结合分析、X射线晶体结构以及单分子成像显示TCR聚集和CD3ζ磷酸化。
- 研究意义
- 揭示γδ TCR识别抗原呈递分子的新几何模式，扩展对T细胞抗原识别机制的理解。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证γδ TCR对CD1a的结合特异性
确认克隆的γδ TCR是否特异结合CD1a而非其他CD1同种型。
将CO3和CO22 TCR转染至HEK293T细胞，用CD1a、CD1b、CD1c和CD1d四聚体染色。
评估γ和δ链对CD1a识别的贡献
确定TCR γ和δ链在CD1a识别中的作用。
替换CO3 TCR的Vγ4或Vδ1链，检测嵌合TCR对CD1a四聚体的结合。
测量γδ TCR与CD1a的亲和力
定量γδ TCR与CD1a的相互作用强度。
通过表面等离子体共振（SPR）测量CO3和CO22 TCR与CD1a-endo及不同脂质负载的CD1a的结合亲和力。
鉴定CD1a上的结合决定因素
确定CD1a上对γδ TCR结合关键的氨基酸残基。
使用CD1a点突变和嵌合蛋白，通过SPR测试对γδ TCR结合的影响。
解析晶体结构
揭示γδ TCR与CD1a结合的原子细节。
解析CO3 γδ TCR单独及其与CD1a-endo、CD1a-sulfatide和CD1a-DDM复合物的晶体结构。
分析结合界面的能量学
验证晶体结构中鉴定的关键相互作用在能量上的重要性。
通过丙氨酸扫描突变CD1a和β2m关键残基，并测量SPR结合亲和力。
评估信号传导
确定侧向结合是否能引发T细胞信号。
在支持脂质双层上刺激稳定表达TCR的Jurkat76细胞，通过单分子成像和DBSCAN分析TCR聚集和CD3ζ磷酸化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| T细胞分选 | CD1a-endo四聚体 | -- | -- |
| 链霉亲和素-APC | Molecular Probes | -- | |
| 链霉亲和素-PE | Invitrogen | -- | |
| 流式细胞术 | BD LSRFortessa | BD Biosciences | -- |
| FACSAria | BD Biosciences | -- | |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 蛋白表达 | FuGENE-6转染试剂 | Promega | -- |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA | -- | -- |
| Superdex200柱 | GE Healthcare | -- | |
| 脂质负载 | 溶血磷脂酰胆碱 | Avanti | 845875 |
| 鞘磷脂C42:2 | Avanti | 860593 | |
| 硫苷脂 | Avanti | 131305 | |
| 双脱氧分枝菌素脂肽 | SYNthesis med chem | -- | |
| SPR | SA传感器芯片 | Cytiva | -- |
| X射线晶体学 | PEG 3350 | -- | -- |
| PEG 4000 | -- | -- | |
| 细胞活化检测 | CD3/CD28磁珠 | Gibco | -- |
| CellTrace Violet细胞示踪染料 | ThermoFisher Scientific | C34571 | |
| Zombie Aqua固定活力试剂盒 | BioLegend | 423101 | |
| 抗人CD3-APC抗体 | BD Biosciences | 557597 | |
| CD69-BV650抗体 | BD Biosciences | 563835 | |
| 免疫染色 | 抗CD3ε-Alexa Fluor 647抗体 | BioLegend | 300416 |
| 抗pCD3ζ-Alexa Fluor 568抗体 | BD Biosciences | 558402 | |
| TetraSpeck微球 | Invitrogen | T7279 | |
| 支持脂质双层制备 | 1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 | Avanti Polar Lipids | 850375C |
| DGS-NTA(Ni)脂质 | Avanti Polar Lipids | 790404C | |
| Biotinyl-Cap-PE脂质 | Avanti Polar Lipids | 870273C | |
| PEG5000-PE脂质 | Avanti Polar Lipids | 880220C | |
| 链霉亲和素 | Invitrogen | S11223 | |
| SLB功能化 | 链霉亲和素 | Invitrogen | 434301 |
| 生物素化CD1a-endo | -- | -- | |
| 生物素化抗CD3抗体 | Invitrogen | 13-0037-82 | |
| 生物素化抗CD28抗体 | Invitrogen | 13-0289-82 | |
| His标签ICAM-1蛋白 | Sino Biological | 10346-H08H | |
| dSTORM成像 | 葡萄糖氧化酶 | Sigma-Aldrich | G2133 |
| 过氧化氢酶 | Sigma-Aldrich | C-100 | |
| 全内反射荧光显微镜（Nanoimager） | ONI | -- | |
| sCMOS相机（ORCA Flash 4） | Hamamatsu | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| T细胞分选 | CD1a-endo四聚体染色浓度2μg/ml，孵育时间10分钟，温度室温。 阅读提示：Methods: Staining and flow cytometry |
| TCR转染 | HEK293T细胞共转染pMIG-TCR和pMIG-CD3γ/δ/ε/ζ，使用FuGENE-6。 阅读提示：Methods: γδ TCR sequencing and transient transfection |
| SPR亲和力测量 | CD1a变体偶联SA芯片，TCR浓度系列，缓冲液20mM Tris pH8, 150mM NaCl, 0.5% BSA。 阅读提示：Methods: Surface plasmon resonance |
| 晶体结构解析 | CO3 γδ TCR与CD1a-endo/sulfatide/DDM摩尔比1:1，结晶条件20% PEG 3350, 0.2M ammonium sulphate等。 阅读提示：Methods: Crystallisation, data collection and structure determination |
| SLB刺激实验 | SLB含有96.5% DOPC, 2% DGS-NTA(Ni), 1% Biotinyl-Cap-PE, 0.5% PEG5000-PE；CD1a-endo浓度500 ng/ml；刺激时间5分钟。 阅读提示：Methods: Preparation of supported lipid bilayer (SLB) and Stimulation |