基因构建与载体构建
构建能表达抗hMMP9抗体HC和LC的基因并插入表达载体。
将抗hMMP9抗体的HC和LC基因（基于PDB: 5th9）进行密码子优化，并分别插入pcDNA3.1(-)载体，构建pcDNA3.1(-)::anti-hMMP9 HC和LC。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
开发用于稳定生产抗人MMP9重组抗体的CHO细胞系
Development of a CHO cell line for stable production of recombinant antibodies against human MMP9.
实验完整度
中包含基因克隆、细胞培养、转染、筛选、纯化及ELISA验证，但缺乏动物模型或患者样本等体内验证。
主要模型
CHO-K1细胞 重组抗hMMP9抗体表达CHO细胞系
重点核对
使用pcDNA3.1(-)载体共转染HC和LC基因至CHO-K1细胞 转染后使用600 μg/mL G-418进行筛选 通过有限稀释克隆选择单克隆，并进一步筛选高表达克隆 通过SDS-PAGE和ELISA验证抗体表达和抗原结合活性
摘要
背景：人基质金属蛋白酶9（hMMP9）是包括癌症在内的多种疾病的生物标志物，对开发hMMP9的检测器和抑制剂的需求日益增加。由于针对hMMP9的抗体可以选择性地结合hMMP9，使用抗MMP9抗体为处理hMMP9相关疾病提供了新的可能性。在本研究中，我们旨在建立稳定的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，用于稳定生产针对hMMP9的抗体。结果：我们构建了重组抗hMMP9抗体片段表达基因，并将其转染至CHO细胞。我们选择了一个单克隆，成功生产了具有高纯度、高灵敏度和高重现性的全尺寸抗hMMP9抗体。随后，我们确认了该抗体的抗原结合效率。结论：我们通过基于CHO细胞的哺乳动物表达系统开发了一种新型重组抗hMMP9抗体，该系统在广泛的医学和工业领域具有很高的应用潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何建立稳定的CHO细胞系以高效生产具有高抗原结合活性的抗hMMP9重组抗体？
- 核心机制
- 通过CHO细胞表达系统生产重组抗体，利用其正确的翻译后修饰和折叠能力，获得具有高抗原结合活性的抗体。
- 主要证据
- 通过SDS-PAGE验证抗体正确表达，ELISA确认抗原结合活性，克隆#6-5的LOD为28.88 ng，灵敏度比商业抗体高10倍。
- 研究意义
- 该CHO细胞系可稳定生产抗hMMP9抗体，有望用于炎症和癌症相关疾病的检测和治疗，并为工业重组抗体表达平台提供新方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞培养与适应悬浮
获得适应悬浮培养的CHO细胞以用于转染和生产。
将贴壁CHO-K1细胞逐步适应至无血清悬浮培养，使用ProCHO-AT、ProCHO4和ProCHO5培养基。
转染与稳定细胞系筛选
获得稳定表达抗hMMP9抗体的单克隆细胞系。
使用Lipofectamine3000共转染HC和LC表达质粒，通过G-418筛选和有限稀释克隆选择稳定表达克隆。
抗体纯化与质量分析
纯化抗体并验证其正确性和纯度。
从细胞上清中纯化抗体，通过Protein A亲和层析和SDS-PAGE分析。
抗原结合活性验证
确认抗体的抗原结合效率和灵敏度。
通过夹心ELISA测定抗体对hMMP9的结合活性，并检测不同浓度抗原下的信号。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因克隆 | pcDNA3.1(-)载体 | -- | -- |
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| ProCHO-AT培养基 | Lonza | -- | |
| ProCHO4培养基 | Lonza | -- | |
| ProCHO5培养基 | Lonza | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine3000转染试剂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 筛选 | 遗传霉素（G-418） | -- | -- |
| 抗体纯化 | Protein A琼脂糖树脂 | -- | -- |
| 甘氨酸 | -- | -- | |
| ELISA | 重组人MMP9蛋白 | Sino Biological | -- |
| HRP标记兔抗hMMP9抗体 | Sino Biological | -- | |
| TMB底物溶液 | -- | -- | |
| 仪器 | Nanodrop微量分光光度计 | -- | -- |
| 酶标仪Model 680 | Bio-Rad | -- | |
| 荧光显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因构建 | 使用pcDNA3.1(-)载体，HC和LC基因分别插入，信号肽序列正确 阅读提示：Methods: Gene cloning |
| 细胞培养与适应 | CHO-K1细胞来源（ATCC CCL-61），培养基从RPMI 1640更换至ProCHO系列，细胞密度、培养时间和搅拌速度 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 转染与筛选 | Lipofectamine3000转染效率，G-418浓度（600 μg/mL），有限稀释克隆的筛选时间（2-3周） 阅读提示：Methods: Transfection, selection, and single-cell cloning |
| 抗体纯化 | Protein A树脂用量、洗脱条件和抗体浓度测定方法 阅读提示：Methods: Purification of antibody |
| ELISA | 包被抗体量、抗原量、检测抗体量、孵育时间和洗涤条件 阅读提示：Methods: Confirmation of the antigen-binding efficiency |