EuNPs与RBD/IgY偶联
制备用于检测的荧光纳米探针。
通过EDC/sulfo-NHS活化EuNPs，将RBD和鸡IgY偶联到EuNPs上。
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双检测荧光免疫层析法定量检测SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-ACE2阻断中和抗体
Dual-detection fluorescent immunochromatographic assay for quantitative detection of SARS-CoV-2 spike RBD-ACE2 blocking neutralizing antibody.
实验完整度
高包含多个独立证据层级：体外免疫层析试纸条构建与优化、EuNPs表征、临床血清样本验证（266例）、WHO参考品与验证盘评估，并进行了功能验证与一致性分析。
主要模型
EuNPs标记RBD的免疫层析试纸条 266份临床血清样本 WHO国际标准品和参考品 恢复期血浆样本
重点核对
样本类型：血清或全血，血清用量10 μL，全血20 μL 样本稀释：80 μL样本稀释液 检测时间：15分钟 T1线包被ACE2浓度：0.5 mg/mL T2线包被抗人IgG/IgM/IgA浓度：1 mg/mL EuNPs标记RBD用量：0.3 μg/条
摘要
全球抗击COVID-19疫情的努力表明，常规定量检测SARS-CoV-2中和抗体对于评估针对新变异株周期性再接种后的免疫力至关重要。本文报道了一种具有内置自校准过程的双检测荧光免疫层析法（DFIA），能够快速定量检测阻断SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合的中和抗体。该检测基于中和抗体抑制ACE2与SARS-CoV-2刺突蛋白RBD结合的能力，以及抗人免疫球蛋白与这些中和抗体的亲和力。由于引入了针对分析物的双反向连接信号的比率算法，自校准DFIA表现出更高的精密度和灵敏度，以及更宽的动态线性范围。验证阴性样本中未观察到阳性结果（0/14），而在23份验证恢复期血浆样本中检测出22份阳性。对包括疫苗接种者在内的266份临床血清样本进行中和抗体检测能力的比较分析表明，DFIA与商业ELISA试剂盒的总体百分比一致性为90.98%。因此，所提出的DFIA为社区中检测SARS-CoV-2感染和疫苗接种提供了一种更可靠、更准确的快速检测方法。基于亲和和抑制反应的比率算法所构建的DFIA生物标志物检测策略，可能有助于提高免疫层析法的性能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发一种能够快速、定量检测SARS-CoV-2中和抗体的免疫层析方法，并评估其性能。
- 核心机制
- 利用中和抗体抑制RBD与ACE2结合的原理，以及抗人免疫球蛋白捕获中和抗体的能力，通过双反向信号的比率算法实现定量检测。
- 主要证据
- 通过临床样本（266份）和WHO参考品验证，DFIA与商业ELISA的总体一致性为90.98%，LOD为7.6 IU/mL，线性范围为12.5-1000 IU/mL。
- 研究意义
- 该方法为SARS-CoV-2感染和疫苗接种的监测提供了一种可靠、准确的快速检测工具，并可能推广到其他生物标志物的免疫层析检测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
DFIA试纸条制备
组装含有T1、T2和C线的免疫层析试纸条。
将RBD偶联EuNPs喷涂于结合垫，ACE2和抗人免疫球蛋白分别包被T1和T2线，抗鸡IgY包被C线。
检测条件优化
确定最佳检测时间、RBD标记量和ACE2包被浓度。
通过测量不同时间点的R值、不同RBD标记量和ACE2包被浓度的响应，确定最优条件。
性能评估
评估方法的检测限、线性、精密度和回收率。
计算LOB、LOD，进行线性回归分析和回收率实验。
临床样本验证
比较DFIA与商业ELISA在临床样本中的检测一致性。
检测266份血清样本，包括疫苗接种者，与cPass ELISA结果比较。
标准品和验证盘评估
用国际标准品和参考盘确认检测结果的准确性和可追溯性。
检测WHO参考品和验证盘样本，分析回收率和一致性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫试剂 | 重组SARS CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD） | Sino Biological Inc | 40592-V05H |
| 重组人血管紧张素转换酶2（ACE2） | Sino Biological Inc | 10108-H08H | |
| 抗体 | 山羊抗人IgG、IgM和IgA抗体 | Abcam | ab102416 |
| 荧光标记 | 羧基功能化铕螯合物纳米颗粒（EuNPs） | Bangs Laboratories | FCEU001 |
| 免疫层析 | 侧向流硝酸纤维素膜（Vivid 120） | Pall Corporation | -- |
| 玻璃纤维结合垫、吸收垫和血液分离样品垫 | Shanghai Kinbio Tech. Co., Ltd | -- | |
| 封闭剂 | 牛血清白蛋白（BSA） | Roche | -- |
| 抗体 | 小鼠抗人红细胞抗体 | Eastmo Biotech Co., Ltd | -- |
| 化学试剂 | 2-(N-吗啉代)乙磺酸（MES） | Sigma-Aldrich | -- |
| 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC） | Sigma-Aldrich | -- | |
| 防腐剂 | Proclin-300 | Sigma-Aldrich | -- |
| 化学试剂 | N-羟基硫代琥珀酰亚胺（sulfo-NHS） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 封闭剂 | Blockmaster™ PA1080 | JSR Life Sciences | -- |
| 生物化学试剂 | 吐温20 | Sinopharm | -- |
| 其他 | Amicon Ultra离心过滤装置（10 kDa） | Merck Millipore | -- |
| 参考品 | cPass SARS-CoV-2中和抗体检测试剂盒 | GenScript USA Inc. | -- |
| 标准品 | 首份WHO抗SARS-CoV-2免疫球蛋白国际标准品（NIBSC代码：20/136） | NIBSC | -- |
| 首份WHO抗SARS-CoV-2免疫球蛋白国际参考品（NIBSC代码：20/268） | NIBSC | -- | |
| 参考品 | 抗SARS-CoV-2血清学检测验证盘 | NIBSC | -- |
| 仪器 | FIC-H1W干式荧光免疫分析仪 | Suzhou Helmen Precision Instruments Co., Ltd. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 探针制备 | EuNPs浓度、EDC/sulfo-NHS浓度、偶联抗原量、反应温度和时间 阅读提示：Materials and methods 2.2 |
| 试纸条制备 | ACE2包被浓度、抗人IgG/IgM/IgA包被浓度、抗鸡IgY浓度、喷涂量、干燥条件 阅读提示：Materials and methods 2.3 |
| 检测流程 | 样本类型和体积、样本稀释液体积、迁移时间、检测波长 阅读提示：Materials and methods 2.4 |
| 性能评估 | 校准品浓度范围、线性范围、LOD、精密度、回收率 阅读提示：Results and discussion 3.5 |
| 临床验证 | 临床样本数、分组、ELISA试剂盒判读标准、DFIA cut-off值 阅读提示：Results and discussion 3.6 |