抗体的产生和纯化
获得用于结构和功能研究的抗体。
ADI-62113 IgG在酿酒酵母中表达，通过蛋白A层析纯化；Fab通过木瓜蛋白酶消化和层析纯化；MOD8_P2_IgG_B11-P1369和PZF12_P2_IgG_F7-P1369在ExpiCHO细胞中瞬时转染表达。
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对SARS-CoV-2具有反复出现的YYDRxG基序的人抗体保留了与包括Omicron在内的关注变体的结合和中和能力
Human antibodies to SARS-CoV-2 with a recurring YYDRxG motif retain binding and neutralization to variants of concern including Omicron.
实验完整度
高包括X射线晶体结构、酵母表面展示结合分析、ELISA、假病毒中和试验等多种实验层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293T细胞 HeLa-hACE2细胞 酵母表面展示的sarbecovirus RBD COVID-19患者和疫苗受试者来源的抗体序列
重点核对
抗体ADI-62113的CDR H3长度（IMGT定义≥18残基） IGHD3-22的读框（RF2） YYDRxG基序中关键残基（如S100b至R100b的体细胞突变） 抗体的CDR H3长度（19-26残基）与中和活性的相关性
摘要
研究针对SARS-CoV-2的抗体反应，有助于了解人体免疫系统如何应对抗原变异以及其他SARS相关病毒。在此，我们通过结构鉴定了一个由IGHD3-22编码的CDR H3中的YYDRxG基序，该基序促进抗体靶向SARS-CoV-2受体结合域上一个功能保守的表位。对公开可用序列中YYDRxG模式的计算搜索发现了100个此类抗体，其中许多可以中和SARS-CoV-2变体和SARS-CoV。因此，YYDRxG基序代表了人类体液免疫系统靶向包括Omicron变体在内的sarbecoviruses的常见趋同解决方案。这些发现提出了一种表位靶向策略，用于识别强效且广泛中和的抗体，以设计泛sarbecovirus疫苗和抗体疗法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类免疫系统如何产生能够广泛中和SARS-CoV-2变体和其他sarbecoviruses的抗体？
- 核心机制
- 由IGHD3-22基因编码的YYDRxG基序在CDR H3中形成保守结构，通过极性、疏水和酰胺-π相互作用靶向RBD上的CR3022表位，从而赋予广谱中和活性。
- 主要证据
- 通过X射线晶体结构解析ADI-62113与RBD的复合物，比较COVA1-16，计算搜索识别YYDRxG抗体，并验证其结合和中和SARS-CoV-2变体及SARS-CoV。
- 研究意义
- YYDRxG基序可作为泛sarbecovirus疫苗设计和抗体疗法的靶向策略，其血清中的丰度可作为中和广度的生物标志物。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
晶体结构测定
解析ADI-62113与SARS-CoV-2 RBD复合物的结构，以理解结合机制。
将Fab与RBD等摩尔混合，结晶，收集衍射数据，通过分子置换解析结构。
结合特异性分析
评估ADI-62113和其他YYDRxG抗体对多种sarbecovirus RBD的结合广度。
通过酵母表面展示和ELISA检测抗体与不同sarbecovirus RBD的结合。
中和活性测定
评估YYDRxG抗体对SARS-CoV-2、VOC和SARS-CoV的假病毒中和能力。
使用假病毒系统，在HeLa-hACE2细胞上进行中和试验。
序列模式搜索
在公共抗体库中识别含有YYDRxG基序的抗体。
从GenBank和先前出版物收集超过205,000条抗体序列，使用PyIR和IgBLAST分析，应用YYDRxG模式搜索并筛选长度约束。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达 | pFastBac载体 | -- | -- |
| Bac-to-Bac系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| FuGENE HD转染试剂 | Promega | -- | |
| Ni-NTA树脂 | QIAGEN | -- | |
| 蛋白质纯化 | HiLoad Superdex 200 pg 色谱柱 | Cytiva | -- |
| 蛋白质表达 | CaptureSelect™ IgG-CH1亲和树脂 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 抗体表达 | ExpiCHO细胞 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| ExpiFectamine™ CHO转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白质纯化 | CaptureSelect™ CH1-XL基质柱 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 结合分析 | APC偶联小鼠抗血凝素标签(HA).11抗体 | BioLegend | 901524 |
| PE偶联山羊抗人IgG多克隆抗体 | Southern Biotech | 2040-09 | |
| 碘化丙啶 | Invitrogen | P1304MP | |
| BD FACS Canto II流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| ELISA | SARS-CoV-2野生型RBD蛋白 | Acro Biosystems | SPD-C52H3 |
| Beta变体RBD蛋白 | Acro Biosystems | SPD-C52Hp | |
| Delta变体RBD蛋白 | Acro Biosystems | SPD-C52Hh | |
| Omicron变体RBD蛋白 | Acro Biosystems | SPD-C522e | |
| HRP偶联抗人IgG抗体 | Jackson ImmunoResearch | 109-036-088 | |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液 | Thermo Fisher Scientific | 34029 | |
| Spectramax酶标仪 | Molecular Devices | -- | |
| 中和试验 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 |
| 链霉亲和素-Alexa Fluor 647 | Thermo | S32357 | |
| DEAE-葡聚糖 | Sigma | 93556-1G | |
| Bright-Glo荧光素酶检测试剂 | Promega | PR-E2620 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 晶体结构测定 | Fab与RBD等摩尔比，孵育条件（4°C过夜），结晶起始浓度11.9 mg/ml，晶体生长条件（0.08 M乙酸钠pH 4.6，0.16 M硫酸铵，20% PEG 4000，20%甘油），衍射数据收集温度100K 阅读提示：Methods: Crystallization and X-ray structure determination |
| 结合分析（酵母表面展示） | 酵母菌株EBY100，RBD表达诱导条件（SGCAA培养基，20°C，16-20小时，180 rpm），抗体滴定范围（100 nM至0.5 pM），洗涤缓冲液PBSF（1×PBS, 0.1% BSA），二次检测抗体稀释度（1:100） 阅读提示：Methods: Binding to sarbecovirus RBDs via yeast surface display |
| ELISA | RBD包被浓度（5 μg/ml），封闭条件（3% BSA-PBS，1小时，37°C），抗体稀释缓冲液（PBS+1% BSA, 0.05% Tween-20），检测抗体稀释度（1:5000），TMB底物孵育时间（30分钟，37°C） 阅读提示：Methods: Binding to SARS-CoV-2 variant RBDs using ELISA |
| 假病毒中和试验 | HeLa-hACE2细胞，假病毒与抗体孵育条件（37°C，1小时），细胞浓度（2×10^5/ml），DEAE-dextran浓度（20 μg/ml），孵育时间（48小时），重复数（至少两次生物重复），IC50计算模型（四参数逻辑斯蒂回归） 阅读提示：Methods: Pseudovirus production and neutralization assays |
| 序列模式搜索 | CDR H3长度约束（≥18残基），N端和C端长度约束（≥5和≥7氨基酸），IGHD3-22读框（RF2），体细胞突变要求（S100b至R100b） 阅读提示：Methods: YYDRxG pattern search |