N蛋白表达与纯化
获得两种不同表达方式（带信号肽和不带信号肽）的N蛋白
商业N蛋白（N(SP+)）购自AcroBiosystems，内部表达N蛋白（N(SP-)）在HEK293细胞中瞬时转染表达，并采用MagneHis™蛋白纯化试剂盒纯化。
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严重急性呼吸综合征冠状病毒2核衣壳蛋白的可变翻译后修饰
Variable posttranslational modifications of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 nucleocapsid protein.
实验完整度
高研究包含独立的证据层级：体外表达两种N蛋白制剂（HEK293细胞），并采用糖组学、糖蛋白组学、磷酸化蛋白质组学等多种质谱方法进行功能验证和机制验证。
主要模型
HEK293细胞表达的商业N蛋白（N(SP+)） HEK293细胞内部表达的无信号肽N蛋白（N(SP-)）
重点核对
N蛋白表达体系：HEK293细胞，商业来源（AcroBiosystems）和内部表达（无SP） PTM检测方法：LC-MS/MS，Byonic软件搜索 关键位点：N-糖基化位点N47和N269，O-糖基化位点T148、T165、T166、T205、S206、T391、S404，磷酸化位点T393和S176 糖基化占用率：N47约53%，N269约94%，T148约81%，T165/T166几乎完全占用 磷酸化占用率：S176为44.4%
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起2019冠状病毒病（COVID-19），于2019年在中国开始，并迅速蔓延为全球大流行。核衣壳蛋白（N蛋白）高度保守，是冠状病毒中最丰富的蛋白，因此是疫苗和即时检测的潜在靶点。文献中已提示N蛋白存在翻译后修饰（PTM），而精确定义这些PTM对其在医学中的潜在应用至关重要。关于N蛋白磷酸化的报道未能提供详细的位点特异性信息。我们对两种不同的N蛋白制剂进行了全面的糖组学、糖蛋白组学和蛋白质组学实验。两者均在HEK293细胞中表达；一种为内部表达并无信号肽（SP）序列纯化，另一种为商业生产并带有SP引导其进入分泌途径。我们的结果显示两种N蛋白制剂上的PTM完全不同。商业产品含有广泛的N-和O-连接糖基化以及Thr393位点的O-磷酸化。相反，天然N蛋白模型在Ser176处有O-磷酸化且无糖基化，这强调了了解用于科学或临床研究的任何商业蛋白来源的重要性。近期研究表明，N蛋白可作为COVID-19的重要诊断标志物，并通过引发保护性免疫应答作为主要免疫原。因此，N蛋白的详细结构表征可能为理解PTM在病毒发病机制、疫苗设计和即时检测开发中的作用提供有用的见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2核衣壳蛋白的翻译后修饰（PTM）位点及不同表达方式（有无信号肽）对PTM的影响。
- 核心机制
- N蛋白的翻译后修饰（糖基化和磷酸化）受表达途径影响：带信号肽的商业N蛋白进入分泌途径发生广泛N-和O-糖基化及Thr393磷酸化，而无信号肽的天然N蛋白仅发生Ser176磷酸化且无糖基化，可能影响蛋白的功能和诊断应用。
- 主要证据
- 基于HEK293细胞表达两种N蛋白，采用LC-MS/MS进行糖蛋白组学和磷酸化蛋白质组学分析，鉴定到N-糖基化位点N47和N269，O-糖基化位点T148、T165、T166、T205、S206、T391、S404，磷酸化位点T393（商业）和S176（天然）。
- 研究意义
- 该研究强调蛋白质来源对PTM的影响，提示使用商业蛋白可能引入非天然修饰，影响研究结果；详细PTM图谱有助于疫苗设计和即时检测开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
N-糖基化鉴定
鉴定N蛋白上的N-连接糖基化位点及聚糖形式
对N(SP+)进行蛋白酶消化（胰蛋白酶/弹性蛋白酶），LC-MS/MS分析，Byonic软件搜索，结合18O标记实验确认位点。
O-糖基化鉴定
鉴定N蛋白上的O-连接糖基化位点及聚糖类型
对N(SP+)进行PNGase F去N-糖后，蛋白酶消化，LC-MS/MS分析，采用HCD、CID和ETD碎裂进行位点定位。
磷酸化鉴定
鉴定N蛋白上的磷酸化位点
对N(SP+)和N(SP-)进行蛋白酶消化，LC-MS/MS分析，Byonic搜索磷酸化修饰，并手工验证。
糖组学分析
分析N(SP+)上释放的N-和O-聚糖的结构
从N(SP+)释放N-糖（PNGase F）和O-糖（β-消除），通过MALDI-MS和ESI-MSn分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与表达 | FreeStyle™ 293-F细胞 | ThermoFisher Scientific | -- |
| 蛋白纯化 | MagneHis™蛋白纯化试剂盒 | Promega | V8500 |
| 质粒DNA | Sino Biological | VG40588-CH | |
| MagneHis™镍颗粒 | Promega | -- | |
| 蛋白表达 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences, Inc. | -- |
| 丙戊酸 | -- | -- | |
| 糖基化分析 | 肽N-糖苷酶F | New England Biolabs | -- |
| 胰蛋白酶 | Promega | -- | |
| 弹性蛋白酶 | Promega | -- | |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion Tribrid质谱仪 | ThermoFisher | -- |
| AB Sciex 5800 MALDI-TOF-TOF质谱仪 | AB Sciex | -- | |
| 色谱分离 | 纳升液相色谱柱 | ThermoFisher | 164568 |
| 蛋白纯化 | Purelink Hipure质粒大提试剂盒 | Invitrogen | K210006 |
| 10 kDa截留分子量过滤器 | -- | -- | |
| 蛋白表达 | EX-Cell表达培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| Freestyle™293表达培养基 | ThermoFisher Scientific | -- | |
| 谷氨酰胺补充剂 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶 | -- | -- | |
| 蛋白纯化 | HRP标记抗His标签抗体 | Biolegend | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| N蛋白表达 | 细胞密度、转染密度、培养基比例、转染试剂浓度、丙戊酸浓度、表达时间 阅读提示：参见Materials and Methods中Expression of N protein in HEK293 cells部分 |
| N蛋白纯化 | 裂解缓冲液、咪唑浓度、洗涤次数、洗脱缓冲液 阅读提示：参见Materials and Methods中Purification of N protein in HEK293F cells without SP N(SP-)部分 |
| N-糖基化分析 | 蛋白酶（胰蛋白酶/弹性蛋白酶）、消化时间、LC-MS/MS设置（分辨率、梯度）、18O标记条件 阅读提示：参见Materials and Methods中N-和O-linked glycan release, purification and permethylation of N(SP+)及Protease digestion for glycoproteomics of N protein, N(SP+)部分 |
| O-糖基化分析 | PNGase F处理、ETD碎裂条件、位点占用率 阅读提示：参见Materials and Methods中O-linked glycosylation of N(SP+)部分及图5 |
| 磷酸化分析 | 蛋白酶消化、Byonic搜索参数、位点占用率 阅读提示：参见Materials and Methods中Data analysis of glycoproteins部分及图6 |