构建MHCII突变体文库
生成I-Ab beta链在CD4结合位点（137、142、148、158）的随机突变库，以筛选增强CD4结合的变体。
通过细菌文库构建I-Ab beta链突变库，利用Flp-In系统在CHO细胞中表达单个突变体，用CD4四聚体进行富集并测序鉴定。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
经工程改造增强与CD4结合的MHC II类四聚体提高对抗原特异性T细胞的检测能力
MHC class II tetramers engineered for enhanced binding to CD4 improve detection of antigen-specific T cells.
实验完整度
高包含分子进化筛选、四聚体结合检测、CD4依赖验证、生物膜力探针亲和力测量、免疫小鼠多肽特异性检测及不同小鼠品系统验证，具有多个独立证据层级和功能验证。
主要模型
B3K508 TCR转基因小鼠T细胞 SMARTA TCR转基因小鼠T细胞 免疫B6小鼠的淋巴结和脾细胞 免疫BALB/c和NOD小鼠的淋巴结和脾细胞 CHO细胞系（用于文库筛选）
重点核对
CD4和MHCII四聚体染色浓度：10 nM 免疫方案：10 μg肽皮下免疫，7天后分析 肽段：P5R、2W、OVA3、GP66、MOGp、P31 CD4依赖验证：CRISPR/Cas9敲除Cd4基因后四聚体结合消失 亲和力测量：生物膜力探针显示I-Ab-4E与CD4亲和力比野生型高10倍
摘要
识别结合主要组织相容性复合体（MHC）分子的特定肽抗原的T细胞的能力，使得对负责细胞介导免疫的淋巴细胞进行计数和分子表征成为可能。荧光标记的肽：MHCI（p:MHCI）四聚体是通过流式细胞术鉴定抗原特异性CD8+ T细胞的成熟试剂，但将该方法扩展到CD4+ T细胞的尝试不太成功，这或许是由于CD4与MHCII分子之间的结合强度较低。在这里我们展示了通过定向进化改造的增强CD4结合的p:MHCII四聚体在检测同源T细胞方面优于常规四聚体。使用工程化四聚体，我们鉴定出免疫多种肽的小鼠中抗原特异性CD4+ T细胞的数量约为使用传统四聚体时的两倍。因此，CD4亲和力增强的p:MHCII四聚体允许直接采样常规p:MHCII四聚体技术无法触及的抗原特异性CD4+ T细胞。这些新试剂可能提供对T细胞库更深入的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何提高p:MHCII四聚体检测低亲和力TCR的CD4+ T细胞的能力？
- 核心机制
- I-Ab-4E突变（V142I、I148Y、L158D）增强了MHCII与CD4的结合亲和力，从而增强四聚体与低亲和力TCR的总体结合。
- 主要证据
- 工程化I-Ab-4E四聚体检测免疫小鼠中CD4+ T细胞数量比常规四聚体增加1.3至4.2倍；CD4基因敲除后结合丧失；生物膜力探针测量显示I-Ab-4E与CD4亲和力提高10倍。
- 研究意义
- 该技术能够检测先前隐藏的表位特异性CD4+ T细胞，可能对T细胞库的功能研究提供更深入理解，并有望用于治疗性激活或抑制表位特异性T细胞。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证突变体的CD4结合增强
确认I-Ab-4E突变体与CD4的结合增强，且依赖于CD4。
用P5R:I-Ab-4E四聚体染色B3K508 TCR转基因T细胞，并通过CRISPR/Cas9敲除CD4验证结合依赖性；用生物膜力探针测量CD4与I-Ab-4E的亲和力。
检测免疫小鼠中的内源性CD4+ T细胞
评估I-Ab-4E四聚体检测免疫后多克隆CD4+ T细胞的能力。
用五种肽免疫B6小鼠，7天后取脾和淋巴结，用I-Ab或I-Ab-4E四聚体染色并磁珠富集，流式计数。
验证其他小鼠品系中的适用性
检验4E突变能否提高其他MHCII等位基因（I-Ad、I-Ag7）四聚体的检测能力。
将4E突变引入I-Ad和I-Ag7，构建四聚体，免疫BALB/c和NOD小鼠，比较突变体与野生型的检测细胞数。
验证肽特异性
确认I-Ab-4E四聚体结合是肽特异的，而非非特异性结合。
免疫P5R或MOGp的小鼠，分别染色两种四聚体，观察CD44表达模式，验证只检测到相应肽特异效应T细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Flp-In-CHO细胞系 | Thermo Fisher | -- |
| Ham's F12培养基 | Thermo Fisher | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Zeocin | Thermo Fisher | -- | |
| 转染 | Lipofectamine | ThermoFisher | -- |
| 细胞筛选 | G418遗传霉素 | ThermoFisher | -- |
| 分子克隆 | pcDNA5/FRT载体 | Thermo Fisher | -- |
| HindIII | NEB | -- | |
| In-Fusion克隆 | Takara Bio USA | -- | |
| Stellar感受态细胞 | Takara Bio USA | -- | |
| 蛋白表达 | pRMHa3载体 | -- | -- |
| pOG44质粒 | -- | -- | |
| 四聚体制备 | 链霉亲和素-藻红蛋白 | Prozyme | -- |
| 链霉亲和素-别藻蓝蛋白 | Prozyme | -- | |
| 流式染色 | Ghost Dye Red 780活力染料 | Tonbo Biosciences | -- |
| BV786标记CD4抗体 | BD Biosciences | -- | |
| APC-eF780标记B220抗体 | eBioscience | 47-0452-82 | |
| CD11b抗体 | eBioscience | 47-0112-82 | |
| CD11c抗体 | eBioscience | 47-0114-82 | |
| F4/80抗体 | eBioscience | 47-4801-82 | |
| CD90.2抗体 | Biolegend | 140317 | |
| CD4抗体 | BD Bioscience | 563790 | |
| CD8a抗体 | Biolegend | 100723 | |
| CD44抗体 | eBioscience | 56-0441-82 | |
| 流式分析 | LSR II或Fortessa流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 数据分析 | FlowJo软件 | TreeStar | -- |
| CD4蛋白表达 | CD4 cDNA ORF克隆 | Sino Biological | MG50134-CH |
| Platinum Pfx DNA聚合酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 分子克隆 | MinElute PCR纯化试剂盒 | Qiagen | -- |
| EcoRI | NEB | -- | |
| Sal1 | NEB | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Thermo Fisher | -- | |
| 细胞培养 | 果蝇S2细胞 | -- | -- |
| DMEM培养基 | Life Technologies | -- | |
| IMDM培养基 | MilliporeSigma | -- | |
| IL-7 | Tonbo Biosciences | -- | |
| 细胞活化 | CD3抗体 | Bio X Cell | -- |
| CD28抗体 | Bio X Cell | -- | |
| 转导 | 聚凝胺 | MilliporeSigma | -- |
| 细胞分选 | MACS CD4+ T细胞磁珠分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- |
| 免疫 | 完全弗氏佐剂 | -- | -- |
| P5R肽 | -- | -- | |
| 2W肽 | -- | -- | |
| MOG肽35-55 | -- | -- | |
| OVA肽323-339 | -- | -- | |
| P31肽 | -- | -- | |
| GP66肽 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 四聚体染色和富集 | 四聚体浓度10 nM，染色温度37°C，染色时间45分钟 阅读提示：Methods: Cell enrichment and flow cytometry |
| 免疫方案 | 小鼠品系、年龄、性别，肽种类、剂量（10 µg），佐剂（CFA），注射途径（皮下尾部），分析时间（7天后） 阅读提示：Methods: Immunizations |
| CD4依赖验证 | CRISPR/Cas9转导条件、Cd4敲除效率、四聚体染色结果 阅读提示：Methods: CRISPR/Cas9-based editing of the Cd4 gene |
| 亲和力测量 | 生物膜力探针实验参数、T细胞和MHCII包被珠的密度、计算模型 阅读提示：Methods: Biomembrane force probe assay |
| 细胞系和文库构建 | CHO细胞系、转染方法、筛选浓度（Zeocin、G418、潮霉素） 阅读提示：Methods: Production of CHO cells, Molecular evolution |