鉴定CBC相互作用蛋白
鉴定与CBC相互作用的RNA或蛋白，探索先驱翻译轮中的新机制。
通过多聚体分级和免疫沉淀（IP）结合微阵列分析，鉴定与CBP80结合的ncRNA，发现RN7SL1；通过远 western blotting、体外pull-down和突变分析验证CBC与SRP的相互作用。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
先驱翻译轮确保内质网和线粒体蛋白的正确靶向
The pioneer round of translation ensures proper targeting of ER and mitochondrial proteins.
实验完整度
高包含转录组分析、体外生化实验、细胞功能实验、应激反应及线粒体功能验证。
主要模型
HeLa细胞 HEK293T细胞 HEK293-EBNA细胞 HEK293FT细胞
重点核对
CBP80与SRP54的相互作用位点（L34等） SRα或SRβ敲低导致CBC-RNC-SRP复合体积累 CBP80-L34E突变破坏互作并影响功能 CENTRE抑制信号序列mRNA的翻译 SRα/CBP80双敲低诱导胞质应激反应
摘要
新合成mRNA的先驱（或第一）翻译轮主要由核帽结合复合体（CBC）介导。在对多聚体相关和CBC结合的转录本进行的全转录组分析中，我们确定了RN7SL1（信号识别颗粒（SRP）的一种非编码RNA组分）是CBC的相互作用伙伴。直接的CBC–SRP相互作用可防止核糖体-新生链复合体（RNC）–SRP复合体的多肽异常表达，直到后者被正确递送至内质网。这种监控的失败会导致错误折叠蛋白在不适当的细胞内位置异常表达，从而引发胞质应激反应。该监控途径还阻断通过RNC–SRP错误组装在编码线粒体蛋白的mRNA上的蛋白质合成。因此，我们的结果揭示了一个监控途径，其中先驱翻译确保内质网和线粒体蛋白的正确靶向。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 先驱翻译轮如何确保内质网和线粒体蛋白的正确靶向？
- 核心机制
- CBC通过直接与SRP相互作用，维持RNC-SRP复合体处于翻译抑制状态，直至其正确递送至内质网。
- 主要证据
- 通过生化实验证实CBC与SRP直接互作；敲低SR导致CBC-RNC-SRP复合体积累且为翻译抑制状态；双敲低CBP80和SR导致异常蛋白聚集和胞质应激反应。
- 研究意义
- 揭示了一个新的质量监控途径（CENTRE），确保蛋白质靶向准确，为理解蛋白错误靶向相关疾病提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证SR下调对CBC-RNC-SRP复合体积累的影响
验证SR下调是否导致CBC-RNC-SRP复合体积累，并检测其翻译状态。
在HEK293T细胞中敲低SRα或SRβ，通过IP和qRT-PCR检测CBP80相关报告mRNA；利用多聚体分级和IP检测核糖体分布。
检测CBC-RNC-SRP复合体的翻译状态
确定CBC-RNC-SRP复合体是否处于翻译抑制状态。
通过多聚体分级和IP，检测CBP80或eIF4E结合的报告mRNA在多聚体中的分布；用GPx1和ER-GFP报告基因检测蛋白表达。
评估CENTRE缺失对蛋白定位和应激反应的影响
验证CENTRE的生理意义，包括异常蛋白聚集和胞质应激反应。
通过双敲低SRα和CBP80，用共聚焦显微镜观察蛋白定位；通过PLA检测CBC-SRP复合体；通过qRT-PCR检测HSP mRNA水平评估应激反应。
探究CENTRE对线粒体蛋白靶向的作用
确定CENTRE是否也调控线粒体蛋白的合成。
通过GO分析鉴定线粒体相关mRNA，检测PAM16、SLC25A41和ATP5E的表达，测量ADP/ATP比值和线粒体膜电位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Capricorn Scientific | -- |
| 胎牛血清 | Capricorn Scientific | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Capricorn Scientific | -- | |
| Plasmocin | Invivogen | -- | |
| MycoAlert PLUS支原体检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Oligofectamine | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA制备和qRT-PCR | TRIzol试剂 | Life Technologies | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Thermo Fischer Scientific | -- | |
| RevertAid逆转录酶 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| qRT-PCR | LightCycler 480 SYBR Green I Master试剂盒 | Roche | -- |
| Western blotting和免疫沉淀 | 抗eIF4E抗体（编号# 2067） | Cell Signaling Technology | 2067 |
| 抗eIF4E抗体（编号# 610269） | BD Biosciences | 610269 | |
| 抗eIF3b抗体（sc-16377） | Santa Cruz Biotechnology | sc-16377 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体（A5441） | MilliporeSigma | A5441 | |
| 抗IMPα抗体（A300-484A） | Bethyl Laboratories | A300-484A | |
| 抗SRP72抗体（NBP1-89498） | Novus Biologicals | NBP1-89498 | |
| 抗SRP68抗体（11585-1-AP） | Proteintech | 11585-1-AP | |
| 抗SRP54抗体（610940） | BD Biosciences | 610940 | |
| 抗SRP19抗体（16033-1-AP） | Proteintech | 16033-1-AP | |
| 抗SRP9抗体（11195-1-AP） | Proteintech | 11195-1-AP | |
| 抗SRα抗体（H00006734-B02P） | Novus Biologicals | H00006734-B02P | |
| 抗SRβ抗体（NBP2-02028） | Novus Biologicals | NBP2-02028 | |
| 抗p53抗体（2524） | Cell Signaling Technology | 2524 | |
| 抗Y14抗体（MAB2484） | Abnova | MAB2484 | |
| 抗MAGOH抗体（ab38768） | Abcam | ab38768 | |
| 抗DCP1A抗体（D5444） | MilliporeSigma | D5444 | |
| 抗G3BP1抗体（13057-2-AP） | Proteintech | 13057-2-AP | |
| 抗HSF1抗体（4356） | Cell Signaling Technology | 4356 | |
| 抗磷酸化Ser326-HSF1抗体（ab76076） | Abcam | ab76076 | |
| 抗FLAG抗体（14793） | Cell Signaling Technology | 14793 | |
| 抗FLAG抗体（A8592） | MilliporeSigma | A8592 | |
| 抗Myc抗体（9E10; OP10L） | MilliporeSigma | OP10L | |
| 抗GFP抗体（sc-9996） | Santa Cruz Biotechnology | sc-9996 | |
| 抗HA抗体（11867431001） | Roche | 11867431001 | |
| Western blotting | HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体（AP124P） | MilliporeSigma | AP124P |
| HRP标记的山羊抗兔IgG抗体（AP132P） | MilliporeSigma | AP132P | |
| HRP标记的兔抗山羊IgG抗体（A5420） | MilliporeSigma | A5420 | |
| HRP标记的山羊抗大鼠IgG抗体（ab6845） | Abcam | ab6845 | |
| 免疫沉淀 | 甲醛 | Millipore Sigma | -- |
| 重组蛋白纯化 | 二甲基亚砜 | Amresco | -- |
| 胰蛋白胨 | Amresco | -- | |
| 无EDTA Pierce™蛋白酶抑制剂片 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Ni-NTA柱 | Qiagen | -- | |
| 咪唑 | MilliporeSigma | -- | |
| HiTrap™ Q HP柱 | GE Healthcare | -- | |
| HiLoad 16/600 Superdex 200 pg柱 | GE Healthcare | -- | |
| 体外pull-down | α-FLAG M1琼脂糖树脂 | MilliporeSigma | -- |
| GMP-PNP | MilliporeSigma | -- | |
| 体外重组实验 | FLAG M2亲和凝胶 | MilliporeSigma | -- |
| 3×FLAG肽 | MilliporeSigma | -- | |
| 免疫沉淀 | 蛋白A琼脂糖4B珠 | Incospharm | -- |
| RNase抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 远western blotting | Hybond ECL硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- |
| 免疫染色 | Triton X-100 | MilliporeSigma | -- |
| 牛血清白蛋白 | Bovogen | BSAS 0.1 | |
| 罗丹明标记的山羊抗兔IgG二抗（31670） | Thermo Fisher Scientific | 31670 | |
| Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG二抗（A-11017） | Invitrogen | A-11017 | |
| MitoTracker | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 显微镜 | LSM 700或LSM 800蔡司显微镜 | Carl Zeiss | -- |
| 邻位连接分析 | 原位邻位连接分析试剂盒 | MilliporeSigma | -- |
| Duolink®原位PLA®探针抗小鼠PLUS | MilliporeSigma | DUO82001 | |
| Duolink®原位PLA®探针抗兔MINUS | MilliporeSigma | DUO82005 | |
| ADP/ATP检测 | ADP/ATP比值检测试剂盒 | MilliporeSigma | -- |
| 线粒体膜电位检测 | TMRE线粒体膜电位检测试剂盒 | BioVision | -- |
| 细胞系建立 | 嘌呤霉素 | MilliporeSigma | -- |
| 微阵列分析 | 低RNA输入线性扩增试剂盒 | Agilent Technologies | -- |
| 安捷伦人寡核苷酸微阵列（44K人基因芯片） | Agilent Technologies | -- | |
| RNA测序 | RNA 6000 Nano芯片 | Agilent Technologies | -- |
| QuantSeq 3′ mRNA测序文库制备试剂盒 | Lexogen | -- | |
| NextSeq 500 | Illumina | -- | |
| TruSeq链特异性mRNA样品制备试剂盒 | Illumina | -- | |
| DNA 1000试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| Kapa文库定量试剂盒 | Kapa Biosystems | -- | |
| HiSeq 2500 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Capricorn Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系（HeLa、HEK293T等）来源和培养条件，包括培养基、血清浓度、抗生素和支原体处理 阅读提示：Methods: Cell culture |
| 转染 | 质粒或siRNA转染方法（如Lipofectamine 2000）、siRNA浓度（100 nM） 阅读提示：Methods: DNA or siRNA transfection |
| 免疫沉淀 | 抗体种类、IP条件（如交联处理、洗涤缓冲液） 阅读提示：Methods: Western blotting, IP and RNA-IP assays |
| 多聚体分级 | 细胞数量、裂解条件、蔗糖梯度、分级后IP步骤 阅读提示：Methods: Polysome fractionation experiments |
| 应激反应检测 | 热休克处理条件（42°C 30分钟）、恢复时间、HSP mRNA检测方法 阅读提示：Results: CENTRE mitigates a cytosolic stress response; Figure 7 legend |
| 线粒体功能检测 | ADP/ATP比值检测方法、TMRE膜电位检测方法、细胞数量、处理时间 阅读提示：Methods: Determination of intracellular ADP/ATP ratio, Measurement of mitochondrial membrane potential |