合成可点击硝基油酸探针
获得能进入细胞并标记硝基烷基化蛋白的化学探针。
通过硝基醛醇缩合反应合成了炔基-(E)-9-硝基油酸（alk-9-NO2-OA），并通过核磁共振确认立体化学。
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化学蛋白质组学揭示硝基脂肪酸的细胞靶点。
Chemoproteomic profiling reveals cellular targets of nitro-fatty acids.
实验完整度
高包含化学探针合成、细胞表型实验（IFN抑制）、蛋白质组学鉴定、生物信息学分析、靶点验证（Western blot）及功能实验（放射性配体结合、分子对接、突变分析）等多个独立证据层级。
主要模型
THP1巨噬细胞 HEK293T/HEK293FT细胞
重点核对
细胞系及培养条件：THP1巨噬细胞由PMA分化，HEK293T/HEK293FT使用DMEM培养基 探针处理浓度和时间：alk-9-NO2-OA 10 μM，15分钟或3.5小时 对照处理：9-NO2-OA和alk-OA作为特异性对照 蛋白质组学筛选标准：至少在3/6样本中检出且排除9-NO2-OA和alk-OA样本 NR3C1突变体：C643S、5C>S、4C>S(C643)用于功能验证
摘要
硝基脂肪酸是一类内源性亲电脂质介质，在多种炎症和纤维化疾病模型中具有抗炎和细胞保护作用。虽然硝基脂肪酸的这些有益生物学效应主要归因于它们与蛋白质形成共价加合物的能力，但已知被硝基烷基化的蛋白质数量很少，蛋白质硝基烷基化的范围仍未确定。在这里，我们描述了可点击硝基脂肪酸探针的合成和应用，用于检测和首次全局鉴定易受硝基烷基化影响的哺乳动物蛋白质。在THP1巨噬细胞中鉴定出184个高置信度硝基烷基化蛋白质，其中大多数是硝基脂肪酸的新靶点，包括延伸突触结合蛋白2（ESYT2）、信号转导和转录激活因子3（STAT3）、Toll样受体2（TLR2）、维甲酸X受体α（RXRα）和糖皮质激素受体（NR3C1）。特别是，我们证明了9-硝基油酸共价修饰并抑制地塞米松与NR3C1的结合。生物信息学分析显示，硝基烷基化蛋白质在内质网和跨膜蛋白中高度富集，并在脂质代谢和转运途径中过度表达。这项研究显著扩大了硝基脂肪酸在活细胞中靶向的蛋白质底物的范围，并为理解硝基脂肪酸作为信号分子或多靶点治疗剂的多种生物学作用提供了有用的资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 硝基脂肪酸在活细胞中的蛋白质靶点及其硝基烷基化的范围是什么？
- 核心机制
- 硝基脂肪酸通过Michael加成反应共价修饰蛋白质半胱氨酸残基，特别是NR3C1的Cys643，从而抑制其配体结合功能。
- 主要证据
- 通过化学蛋白质组学在THP1巨噬细胞中鉴定出184个高置信度硝基烷基化蛋白，包括已知靶点KEAP1、STING和IKBKB，并验证了ESYT2、STAT3、TLR2、RXRα和NR3C1等新靶点。放射性配体结合实验和分子对接表明9-NO2-OA修饰NR3C1的Cys643，突变分析证实该位点影响荧光标记。
- 研究意义
- 显著扩大了硝基脂肪酸蛋白靶点的范围，提供了理解其多效性生物学作用和多靶点治疗潜力的资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证探针标记细胞蛋白
验证探针能够进入活细胞并标记已知硝基烷基化蛋白如KEAP1。
用不同浓度和时间处理HEK293FT细胞，通过点击化学偶联叠氮-罗丹明，进行凝胶内荧光检测。
验证探针保留抑制I型干扰素应答的活性
确认添加炔基的探针仍具有母体化合物的生物活性。
用PMA分化的THP1巨噬细胞，用脂肪酸预处理后以cGAMP刺激，检测I型干扰素产生和细胞活力。
富集和鉴定硝基烷基化蛋白
全局鉴定活细胞中硝基烷基化的蛋白靶点。
用alk-9-NO2-OA处理THP1巨噬细胞，裂解后点击化学偶联生物素，通过NeutrAvidin富集，胰酶消化后进行LC-MS/MS分析。
生物信息学分析硝基烷基化蛋白
分析硝基烷基化蛋白的特征和功能富集。
对184个高置信度蛋白进行GO富集分析、拓扑分析、通路分析和与其它亲电体靶点的比较分析。
验证新硝基烷基化蛋白
确认蛋白质组学鉴定的候选蛋白确实被硝基烷基化。
选择ESYT2、STAT3、TLR2、RXRα和NR3C1进行Western blot验证，并检测低浓度探针下的修饰。
评估硝基化对NR3C1功能的影响
探究硝基烷基化是否影响糖皮质激素受体的配体结合能力。
进行放射性配体结合实验，测试9-NO2-OA和10-NO2-OA对地塞米松结合的抑制，并通过分子对接预测结合位点。
验证NR3C1的硝基烷基化位点
实验验证Cys643是否为9-NO2-OA的主要修饰位点。
在HEK293T细胞中过表达野生型NR3C1和半胱氨酸突变体，用alk-9-NO2-OA处理后进行荧光检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞分化 | PMA（佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯） | -- | P1585 |
| 细胞培养 | 脂质体转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞刺激 | cGAMP（2'3'-环鸟苷酸-腺苷酸） | InvivoGen | -- |
| 细胞活力检测 | CellTiter 96® MTS检测试剂盒 | Promega | G1111 |
| 点击化学 | 叠氮-罗丹明 | -- | -- |
| 亲和富集 | 重氮-生物素-叠氮 | DC Biosciences | CCR-1041 |
| 蛋白标记 | alk-9-NO2-OA探针 | Cayman Chemicals | 10008042 |
| 油酸 | Cayman Chemicals | 90260 | |
| 9-硝基油酸 | Cayman Chemicals | 10008042 | |
| 10-硝基油酸 | Cayman Chemicals | 10008043 | |
| 细胞裂解 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78437 |
| SuperNuclease核酸酶 | Sino Biological | SSNP01 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | 23225 |
| 点击化学 | TCEP（三(2-羧乙基)膦） | Thermo Scientific | 77720 |
| TBTA（三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺） | -- | -- | |
| 亲和富集 | NeutrAvidin微珠 | Thermo Scientific | 29200 |
| 质谱样品制备 | 胰蛋白酶 | Promega | V5280 |
| 质谱分析 | LTQ-Orbitrap质谱仪 | Thermo Fisher | -- |
| C18离心吸头 | Thermo Scientific | 84850 | |
| Western blot | 抗HA抗体 | Sigma | 05-904 |
| 抗ESYT2抗体 | Sigma | HPA002132 | |
| 抗GAPDH抗体 | Cell Signaling Technology | 5174 | |
| 抗STING抗体 | Cell Signaling Technology | 13647 | |
| 抗NR3C1抗体 | Cell Signaling Technology | 12041 | |
| 抗STAT3抗体 | Cell Signaling Technology | 12640 | |
| 抗TLR2抗体 | Cell Signaling Technology | 12276 | |
| 抗RXRα抗体 | Cell Signaling Technology | 3085 | |
| 链霉亲和素-辣根过氧化物酶 | Abcam | 7403 | |
| 抗小鼠辣根过氧化物酶 | Jackson ImmunoResearch | 115-035-003 | |
| 抗兔辣根过氧化物酶 | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| 分子生物学 | QuikChange Lightning多位点定向突变试剂盒 | Stratagene | -- |
| 转染 | TransIT®-LT1转染试剂 | Mirus Bio | -- |
| 放射性配体结合实验 | [3H]地塞米松 | -- | -- |
| 闪烁亲近检测微珠 | -- | -- | |
| 分子对接 | BIOVIA 2018/LigandFit程序 | BIOVIA | -- |
| AutoDock Tools（版本1.5.6） | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和分化 | THP1细胞用200 nM PMA分化48小时，随后静息48小时；HEK293T和HEK293FT用DMEM培养；细胞需置于37°C、5% CO2。 阅读提示：Methods 2.2 Cell lines |
| 探针处理和荧光检测 | 探针浓度、处理时间（用于荧光检测时通常2.5 μM、1小时；用于蛋白质组学时10 μM、15分钟或3.5小时）；点击化学偶联条件（100 μM叠氮-罗丹明，1 mM CuSO4，1 mM TCEP，100 μM TBTA）。 阅读提示：Methods 2.7、Results 3.2 |
| 富集和蛋白质组学 | 细胞裂解量400 μg；点击化学试剂用量（4 μL 10 mM diazo-biotin-azide，8 μL 50 mM CuSO4，8 μL 50 mM TCEP，20 μL 2 mM TBTA）；NeutrAvidin微珠25 μL；洗脱和消化条件（胰酶0.2 μg/500 μg裂解物）。 阅读提示：Methods 2.9 |
| 质谱分析 | LTQ-Orbitrap设置：分辨率为120,000，质量范围400-1450 Da，梯度时间70分钟；数据库：Swiss-Prot human (2020年1月)；固定修饰：半胱氨酸脲甲基化，可变修饰：蛋氨酸氧化。 阅读提示：Methods 2.10、2.11 |
| 功能验证 | I型干扰素检测：THP1巨噬细胞预处理脂肪酸2.5 μM或10 μM 30分钟，cGAMP 4 μg/mL刺激20小时；细胞活力检测：MTS试剂盒。NR3C1结合实验：10 μg受体蛋白，5 nM [3H]地塞米松，4°C孵育24小时。 阅读提示：Methods 2.3、2.4、2.13；Results 3.3、3.6 |