体外筛选DNA适体
从预结构化DNA文库中筛选出能特异性结合SARS-CoV-2 S1蛋白的DNA适体。
利用磁珠法和EMSA法进行SELEX，经过13轮富集，获得高亲和力适体。
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从预先结构的DNA文库中获得的针对野生型和B.1.1.7 SARS-CoV-2刺突蛋白的多种高亲和力DNA适体
Diverse high-affinity DNA aptamers for wild-type and B.1.1.7 SARS-CoV-2 spike proteins from a pre-structured DNA library.
实验完整度
高结合体外SELEX筛选、多种蛋白结合分析（dot blot）、特异性分析、唾液环境适应性测试、热处理稳定性分析，以及基于假病毒的比色夹心检测方法，功能验证与机制验证俱全。
主要模型
SARS-CoV-2 S1蛋白 SARS-CoV-2三聚刺突蛋白 SARS-CoV-2假型慢病毒
重点核对
MSA1和MSA5对S1蛋白的Kd值分别为1.8 nM和2.7 nM MSA1对假型慢病毒的Kd值为22.7 pM，MSA5为11.8 pM MSA1在50%人唾液中结合S1蛋白的Kd值与缓冲液中相当 MSA1对B.1.1.7变异株三聚刺突蛋白的Kd为1.2 nM，较野生型提高16倍
摘要
我们进行了体外选择实验，以鉴定针对SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基（S1蛋白）的DNA适体。使用预结构化随机DNA序列库，在逐渐增加的严格选择压力下经过13轮富集后，获得了100多个候选适体。排名前10的序列均表现出与S1蛋白的强结合。两种适体MSA1（Kd = 1.8 nM）和MSA5（Kd = 2.7 nM）被评估与热处理的S1蛋白、掺入50%人唾液的未处理S1蛋白以及野生型和B.1.1.7变异株的三聚刺突蛋白的结合，在所有情况下均表现出相当的亲和力。MSA1和MSA5还识别SARS-CoV-2的假型慢病毒，Kd值分别为22.7 pM和11.8 pM。二级结构预测和序列截短实验表明，MSA1和MSA5均采用发夹结构，这是原始文库中预设的基序。使用MSA1作为识别元件和检测元件开发了一种比色夹心测定法，能够在50%唾液中检测假型慢病毒，检测限为400 fM，证实了这些适体作为COVID-19检测诊断工具的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 旨在从预结构化DNA文库中筛选出针对SARS-CoV-2 S1蛋白的高亲和力DNA适体，并评估其作为诊断工具的潜力。
- 核心机制
- 适体MSA1和MSA5通过形成发夹结构识别S1蛋白，且对三聚刺突蛋白和假病毒均有高结合亲和力，提示其识别表位可能位于蛋白保守区域。
- 主要证据
- 通过dot blot实验测定各适体的Kd值，MSA1和MSA5对S1蛋白的Kd分别为1.8 nM和2.7 nM；对三聚刺突蛋白的Kd分别为19.8 nM和5.6 nM；对B.1.1.7变异株三聚刺突蛋白的Kd分别为1.2 nM和3.2 nM；对假病毒的Kd分别为22.7 pM和11.8 pM。
- 研究意义
- MSA1和MSA5在50%唾液中保持结合活性，且能耐受65°C热处理，为开发基于唾液样本的COVID-19快速检测方法提供可能。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结合亲和力测定
评估筛选出的适体对S1蛋白的亲和力。
使用dot blot实验测定不同浓度蛋白下适体的结合分数，拟合Kd值。
特异性检验
验证适体对S1蛋白的特异性，排除非特异性结合。
检测适体对BSA、凝血酶、IgG、RNase H2等对照蛋白的结合。
复杂环境适应性测试
评估适体在50%人唾液中对S1蛋白的结合能力。
将S1蛋白掺入50%人唾液，进行dot blot实验测定Kd值。
三聚刺突蛋白结合测试
确认适体能否识别三聚体形式的刺突蛋白。
通过dot blot实验测定适体对三聚刺突蛋白的Kd值。
假病毒结合测试
评估适体对展示全长刺突蛋白的假型病毒的识别能力。
通过dot blot实验测定适体对假型病毒的Kd值。
热处理稳定性分析
验证适体在热处理后是否保持结合活性，为安全检测做准备。
将S1蛋白和假病毒在65°C处理60分钟后，进行dot blot实验。
比色夹心检测开发
开发基于适体的比色检测法，用于在唾液中检测假病毒。
利用生物素化MSA1作为捕获和报告元件，构建夹心检测系统，检测50%唾液中的假病毒。
二级结构预测和截短优化
阐明适体的活性结构域，并最小化适体序列。
使用mfold预测二级结构，设计截短突变体并测定结合活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 适体筛选 | HisPur Ni-NTA磁珠 | Thermo Scientific | -- |
| Taq DNA聚合酶 | GenScript | -- | |
| 结合测定 | 硝酸纤维素印迹膜 | GE Healthcare | 10600125 |
| 尼龙杂交转移膜 | PerkinElmer | NEF994001PK | |
| 比色检测 | Pierce链霉亲和素包被板 | Thermo Scientific | -- |
| 链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶 | Invitrogen | 19534-050 | |
| 1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液 | Thermo Scientific | VL3152681 | |
| 蛋白偶联 | 带有His标签的S1蛋白 | Sino Biological | 40591-V08B1 |
| 蛋白结合 | 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | -- |
| 特异性检验 | 人凝血酶 | Sigma-Aldrich | -- |
| 人血清免疫球蛋白G | Sigma-Aldrich | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 体外筛选 | 文库随机区长度、PCR引物序列及筛选轮数是否严格按照文中所述，特别是磁珠法和EMSA法的结合时间与温度。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Selection of DNA aptamers for S1 proteins’小节及Supplementary Table S1和Table S2。 |
| 结合亲和力测定 | dot blot实验中蛋白浓度梯度、孵育时间及温度，以及测得的Kd值是否与文中一致（如MSA1对S1蛋白Kd为1.8 nM）。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Dot-blot binding assays’小节及Figure 2图注。 |
| 特异性检验 | 对照蛋白的种类和浓度，以及dot blot实验条件。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Experimental details for Figure 3’小节及Figure 3图注。 |
| 唾液适应性 | 人唾液的稀释比例（50%）及是否使用相同的binding buffer，以及dot blot实验条件。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Dot-blot binding assays’小节及Figure 3B图注。 |
| 三聚刺突蛋白结合 | 三聚刺突蛋白的来源和浓度，以及dot blot实验条件。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Experimental details for Figure 2’小节及Figure 2C图注。 |
| 假病毒结合 | 假病毒的浓度测定方法（基于感染293T-ACE2细胞测定荧光素酶）及dot blot实验中孵育时间。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Conjugation of S1 protein to magnetic beads’和‘Dot-blot binding assays’小节及Figure 4C图注。 |
| 热处理稳定性 | 热处理温度（65°C）和时间（60分钟），及处理后的结合测定条件。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Experimental details for Figure 4’小节及Supplementary Figure S9图注。 |
| 比色检测 | MSA1的浓度（500 nM）、HRP稀释比例（1:1000）、TMB孵育时间（20分钟）及假病毒浓度范围（0.5-20 pM）。 阅读提示：Materials and Methods部分‘Experimental details for Figure 5’小节及Figure 5图注。 |
| 结构分析 | mfold预测条件及截短突变体的设计（如MSA1-T1至T6），以及各突变体的Kd值是否与文中一致。 阅读提示：Results部分‘Secondary structure analysis’小节及Figure 6和Figure 7图注。 |