鉴定人类及非人灵长类ACE2变异
从人类和灵长类基因组/基因序列中筛选ACE2变异，特别是位于S蛋白结合位点的变异。
从gnomAD、dbSNP等数据库收集人类ACE2变异，从57种非人灵长类基因组和基因序列中获取ACE2编码序列，通过比对和祖先序列重建推断变异。
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鉴定灵长类ACE2变异体赋予对SARS-CoV-2的抗性
Identifying Primate ACE2 Variants That Confer Resistance to SARS-CoV-2.
实验完整度
高研究包含ACE2序列变异鉴定、细胞水平RBD附着实验、S1结合实验和蛋白质结构分析等独立证据层级，且进行了功能验证和机制验证。
主要模型
HeLa细胞系瞬时表达ACE2变异体 人类及57种非人灵长类的ACE2基因序列 ACE2-S蛋白复合物结构（PDB: 6m0j, 6m17）
重点核对
ACE2变异体在HeLa细胞中的表达效率，通过Western blot确认 RBD附着实验中RBD-LgBiT蛋白的使用量（250 ng）及细胞数（15,000） S1结合实验中S1-hFc蛋白的浓度（120 ng）及孵育时间（1小时） 使用人类野生型ACE2作为对照及结合亲和力变化分类标准（>150%增强，<30%降低等） 结构分析中使用的PDB结构（6m0j, 6m17）及计算工具（Volbl, APBS）
摘要
SARS-CoV-2通过病毒S蛋白与人类血管紧张素转换酶2的结合感染人类。ACE2-S蛋白复合物的结构已被解析，我们关注与S蛋白结合的27个ACE2残基。从人类序列数据库中，我们鉴定了位于ACE2-S蛋白结合位点的9个ACE2变异体。我们同时使用实验分析和蛋白质结构分析来评估每个变异体对ACE2与S蛋白结合亲和力的影响。我们发现一个变异体导致完全结合失能，两个和三个变异体分别强烈和轻度降低结合亲和力，以及两个变异体强烈增强结合亲和力。我们随后收集了57种非人灵长类的ACE2基因序列。在所研究的6种猿类和20种旧世界猴中，我们没有发现新的变异体。相反，所研究的全部11种新世界猴共享四个变异体，每个均导致结合亲和力强烈降低，菲律宾眼镜猴也拥有三个此类变异体，所研究的19种原猴类中有18种共享一个导致结合亲和力强烈降低的变异体。此外，一个旧世界猴和三个原猴类变异体将结合亲和力提高了>50%。基于这些发现，我们提出灵长类的共同祖先对SARS-CoV-2具有强烈抗性，新世界猴的共同祖先以及菲律宾眼镜猴则完全抗性，而猿类和旧世界猴与大多数人类一样易感。这项研究增进了我们对灵长类对SARS-CoV-2感染易感性差异的理解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 人类和灵长类ACE2基因中的变异是否以及如何影响ACE2与SARS-CoV-2 S蛋白的结合亲和力，从而影响宿主对SARS-CoV-2的易感性？
- 核心机制
- ACE2氨基酸残基的变异通过改变界面原子接触、静电势和疏水面积等影响与S蛋白的结合亲和力；例如D355N变异消除了关键接触，而S19P增加了接触。
- 主要证据
- RBD附着实验和S1结合实验显示，D355N、K31E、Y41H等变异几乎完全丧失结合能力，S19P、T27A等变异增强结合；结构分析解释了这些效应。
- 研究意义
- 研究揭示了灵长类对SARS-CoV-2易感性的演化模式，并鉴定了可能赋予人类抗性的ACE2变异，为理解COVID-19易感性差异提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
实验评估ACE2变异体对S蛋白结合的影响
通过实验测定ACE2变异体与S蛋白RBD或S1的结合亲和力变化。
构建SmBiT标记的ACE2变异体并在HeLa细胞中表达，进行RBD附着实验和使用S1-hFc的S1结合实验，检测结合活性。
结构分析预测变异体对结合亲和力的影响
利用蛋白质结构分析解析变异体对ACE2-S蛋白结合界面的原子接触、静电势等的影响。
使用PDB结构6m0j和6m17，通过alpha-shape理论计算原子接触，使用Volbl和APBS等工具分析变异体的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RBD附着实验 | Nano-Glo荧光素酶检测底物 | Promega | -- |
| 重组RBD-LgBiT蛋白 | SMOBIO Inc. | -- | |
| S1结合实验 | Fc标记的刺突S1重组蛋白 | Sino Biological | 40591-V02H |
| Western blot | 兔抗ACE2抗体 | Novus biologicals | SN0754 |
| S1结合实验 | Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔抗体 | Molecular Probes | -- |
| Alexa Fluor 594偶联的山羊抗人抗体 | Molecular Probes | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Leica DMI2000显微镜 | Leica | -- | |
| ACE2质粒构建 | CloneAmp HiFi聚合酶 | Takara Bio | -- |
| pJET1.2载体 | Thermo Scientific | -- | |
| DpnI限制性内切酶 | -- | -- | |
| 凝胶提取试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| T7 DNA连接酶 | New England Biolabs | -- | |
| QIAGEN质粒中提试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| RBD附着实验 | Nano-Glo荧光素酶检测底物 | Promega | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和转染 | HeLa细胞培养条件，转染DNA量（1μg），转染时间（48小时） 阅读提示：见Materials and Methods：Cell-Based RBD Attachment Assay |
| RBD附着实验 | 细胞数量（15,000），RBD-LgBiT蛋白量（250 ng），孵育时间（10分钟），检测时间（1小时） 阅读提示：见Materials and Methods：Cell-Based RBD Attachment Assay及图2B |
| S1结合实验 | S1-hFc蛋白浓度（120 ng），孵育时间（1小时），固定和染色步骤 阅读提示：见Materials and Methods：S1 Binding Assay及图4A |
| Western blot | 一抗(anti-ACE2)的稀释度，二抗的选择，内参GAPDH 阅读提示：见图2D和图3B的图注 |
| 结构分析 | 使用的PDB结构（6m0j, 6m17），计算方法（alpha-shape, Delaunay三角剖分），软件版本（如Volbl, APBS） 阅读提示：见Materials and Methods：Evaluating the Effect of Each ACE Variant |