蛋白表达与消化
获取S蛋白肽段用于糖基化分析
重组S蛋白用尿素变性、DTT还原、IAA烷基化，依次用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶消化。
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双功能化Ti-IMAC材料实现SARS-CoV-2刺突蛋白中性和唾液酸化糖肽的同时富集与分离
Simultaneous enrichment and separation of neutral and sialyl glycopeptides of SARS-CoV-2 spike protein enabled by dual-functionalized Ti-IMAC material.
实验完整度
中包含蛋白质消化、糖肽富集、LC-MS/MS分析和数据处理等完整实验流程，并有与HILIC对比的验证，但缺少体内或细胞功能验证。
主要模型
HEK293细胞表达的重组SARS-CoV-2刺突蛋白
重点核对
重组S蛋白来源：Sino Biological US Inc.，货号40589-V08H4，带有His标签及多处突变 富集方法对比：双功能Ti-IMAC与HILIC，两种方法分别富集2 μg蛋白酶解产物 Ti-IMAC两步洗脱：0.1% FA洗脱中性糖肽，6% TFA洗脱唾液酸化糖肽 LC-MS/MS参数：Orbitrap Fusion Lumos，HCD阶梯碰撞能量22%、30%、38% 数据检索：Byonic V3.10，FDR<1%，PEP 2D<0.05
摘要
由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019冠状病毒病（COVID-19）大流行对全世界人类健康构成严重威胁。有效疫苗的开发一直聚焦于刺突（S）糖蛋白，该蛋白通过与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体的相互作用介导病毒侵入人体细胞。在本工作中，我们对SARS-CoV-2 S糖蛋白的N-和O-连接糖基化进行了分析表征。我们探索了双功能化钛（IV）固定化金属亲和色谱（Ti-IMAC）材料的新用途，用于同时富集和分离来自HEK293细胞的重组SARS-CoV-2 S糖蛋白的中性和唾液酸化糖肽。该策略有助于消除中性糖肽对唾液酸化糖肽检测的信号抑制，并提高了S蛋白的糖型覆盖率。我们使用双功能Ti-IMAC方法分析了其22个潜在N-糖基化位点中的19个，具有398种独特糖型，与常规亲水相互作用色谱（HILIC）糖肽富集方法相比，覆盖率提高了1.6倍。我们还鉴定了使用常规HILIC方法未发现的O-连接糖基化位点。此外，我们报告了甘露糖-6-磷酸（M6P）糖基化的鉴定，这大大扩展了目前对刺突蛋白糖基化景观的认识，并为未来研究刺突蛋白M6P糖基化对其进入细胞的影响提供了可能。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何同时富集和分离SARS-CoV-2刺突蛋白的中性和唾液酸化糖肽，以提高糖基化位点和糖型的覆盖率？
- 核心机制
- 双功能Ti-IMAC材料通过亲水和静电协同作用捕获唾液酸化糖肽，而仅通过亲水作用捕获中性糖肽，两步洗脱实现分离。
- 主要证据
- 基于HEK293细胞表达的重组S蛋白，使用胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶双酶消化，经双功能Ti-IMAC富集后LC-MS/MS分析，鉴定出19个N-糖基化位点、398种糖型，及O-糖基化位点和M6P修饰。
- 研究意义
- 该方法提高了S蛋白糖基化覆盖率，为理解病毒感染中糖基化作用、开发治疗策略和疫苗设计提供知识。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
糖肽富集
同时富集和分离中性和唾液酸化糖肽
将2 μg消化产物加载到双功能Ti-IMAC材料上，在HILIC模式下进行富集，然后两步洗脱。
LC-MS/MS分析
鉴定糖肽序列和糖型
使用nanoLC-Orbitrap Fusion Lumos质谱仪分析富集的糖肽，采用step-HCD碎裂。
数据处理
鉴定糖肽并分类糖型
使用Byonic软件搜索MS/MS谱图，并手动确认M6P糖肽。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白样品 | 重组SARS-CoV-2刺突蛋白 | Sino Biological US Inc. | 40589-V08H4 |
| 蛋白消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 胰凝乳蛋白酶 | Promega | -- | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 尿素 | Sigma-Aldrich | -- | |
| TEAB缓冲液 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 糖肽富集 | Ti(IV)-IMAC材料 | -- | -- |
| HILIC材料（PolyHYDROXYETHYL A） | PolyLC Inc. | -- | |
| 甲酸 | -- | -- | |
| LC-MS/MS分析 | Ultimate 3000纳升液相色谱 | -- | -- |
| Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| BEH C18材料 | Waters | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白消化 | 蛋白浓度、还原剂DTT浓度、烷化剂IAA浓度、酶与底物比例、消化时间 阅读提示：Methods：Protein digestion |
| 糖肽富集 | Ti-IMAC材料用量、上样缓冲液组成、洗脱液组成和顺序 阅读提示：Methods：Glycopeptide enrichment |
| LC-MS/MS分析 | 色谱梯度、流速、MS扫描范围、分辨率、HCD碰撞能量 阅读提示：Methods：LC-MS/MS analysis |
| 数据处理 | 搜索数据库、质量容差、可变修饰设置、FDR阈值 阅读提示：Methods：Data processing |