制备和表征重组POWV EDIII蛋白
生成并验证用于ELISA和免疫分析的对照抗原。
使用毕赤酵母（Komagataella phaffii）表达含有C端组氨酸标签的POWV LB株EDIII蛋白（残基301-401），通过镍亲和色谱纯化；SDS-PAGE和Western blot分析验证其纯度、分子量（12.7 kDa）和与抗体的反应性。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于病毒样颗粒的蜱传波瓦桑病毒疫苗候选物在小鼠模型中诱导中和抗体
A Virus-Like Particle-Based Vaccine Candidate against the Tick-Borne Powassan Virus Induces Neutralizing Antibodies in a Mouse Model.
实验完整度
高研究包含体外VLP制备与表征（Western blot、TEM）、小鼠体内免疫原性与安全性评估（剂量递增、ELISA、中和试验），以及单克隆抗体制备，多层级功能与机制验证。
主要模型
BALB/c小鼠 293T细胞 POW-VLP疫苗
重点核对
BALB/c小鼠，6周龄，每组10只（5雄5雌），用于免疫原性和安全性评估 POW-VLP剂量：1、5、10 μg（EDIII等效抗原），通过肌肉注射，采用初次免疫加两次加强免疫，间隔3周 免疫时间：第1、21、42天，血清在初次免疫和每次加强后3周采集 ELISA检测血清IgG及其亚型，中和活性采用报告病毒颗粒中和试验（PRNT50） 佐剂为AddaVax（角鲨烯-based水包油纳米乳），与疫苗1:1混合
摘要
波瓦桑病毒（POWV）是一种蜱传黄病毒，在北美和俄罗斯远东地区流行，可导致严重的神经侵袭性疾病，包括脑炎、脑膜炎和脑膜脑炎。报道的神经侵袭性病例病死率约为10%，约50%的神经感染幸存者表现出长期或永久性神经系统后遗症。目前，POWV感染的治疗是支持性的，尚无FDA批准的疫苗或特异性疗法。使用病毒样颗粒技术（POW-VLP）创建了一种新型波瓦桑疫苗候选物，并由病毒结构蛋白前膜（prM）和包膜（E）组装而成。蛋白质印迹免疫分析表明POW-VLP结构蛋白具有高抗原性。透射电子显微镜显示POW-VLP表现出黄病毒典型的二十面体形态。在小鼠模型中进行了剂量递增研究，以测试免疫原性和安全性。通过ELISA检测血清抗体，表明POW-VLP对E蛋白具有100%的血清转换率。报告病毒颗粒中和试验表明，免疫小鼠血清中含有高滴度的中和抗体。在POW-VLP免疫后产生了表达单克隆抗体的杂交瘤。本研究中创建的POW-VLP疫苗候选物为诱导针对波瓦桑神经侵袭性感染的保护性抗体提供了一种策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 开发并评估一种基于病毒样颗粒的波瓦桑病毒疫苗候选物（POW-VLP），以诱导针对POWV的中和抗体。
- 核心机制
- POW-VLP由prM-E结构蛋白组装成二十面体形态，展示E蛋白的EDIII结构域，诱导产生针对EDIII的特异性抗体，并激发Th1和Th2免疫应答，产生中和抗体。
- 主要证据
- 通过Western blot和TEM表征POW-VLP的抗原性和形态；小鼠免疫后ELISA显示100%血清转换并诱导剂量依赖的IgG，中和试验显示高滴度中和抗体；并生成了20个针对POWV EDIII的单克隆抗体杂交瘤。
- 研究意义
- 该研究为开发安全有效的基于VLP的POWV疫苗提供了候选物，有望诱导针对波瓦桑神经侵袭性感染的保护性抗体，支持进一步挑战研究和临床前评估。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生产POW-VLP
在哺乳动物细胞中表达和纯化病毒样颗粒。
将编码POWV prM-E基因的质粒转染293T细胞，培养72小时后收集细胞，通过超速离心和蔗糖梯度纯化获得POW-VLP；通过免疫荧光和Western blot确认E蛋白表达。
表征POW-VLP抗原性和形态
确认POW-VLP的蛋白质组成和病毒样结构。
通过Western blot检测E蛋白和prM蛋白，透射电子显微镜观察VLP形态。
小鼠免疫原性和安全性评估
评估POW-VLP在小鼠中的免疫原性、剂量反应和安全性。
对BALB/c小鼠进行剂量递增免疫，使用1、5、10 μg EDIII等效剂量的POW-VLP与AddaVax佐剂混合，通过肌肉注射，初次免疫后两次加强，采集血清通过ELISA检测抗体滴度和IgG亚型。
中和抗体检测
评估POW-VLP免疫血清的中和活性。
使用报告病毒颗粒中和试验，将免疫小鼠血清与报告病毒颗粒混合，接种Vero细胞，通过GFP计数计算PRNT50。
生成单克隆抗体
从免疫小鼠中产生针对POWV EDIII的单克隆抗体。
从高剂量（10 μg）免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，通过ClonaCell-HY试剂盒选择杂交瘤，ELISA和点印迹筛选阳性克隆。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白表达 | POWV EDIII重组蛋白 | BEI Resources | NR-52391 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | ATCC | 30-2002™ |
| 胎牛血清 | ATCC | 30-2020™ | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| 细胞裂解 | 哺乳动物细胞裂解试剂盒 | Sigma-Aldrich | MCL-1 |
| 超滤 | Amicon超滤管（100 kDa截留） | Millipore | UFC910008 |
| 免疫荧光 | 山羊抗小鼠IgG抗体（FITC标记） | Millipore | 5008 |
| 含DAPI的Vectashield封片剂 | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| Western blot | Bolt 4-12% Bis-Tris Plus凝胶 | Thermo Fisher Scientific | NW04120BOX |
| 抗兰加特病毒包膜糖蛋白单克隆抗体（克隆10F6） | BEI Resources | NR-40316 | |
| His标签抗体（H-3） | Santa Cruz Biotechnology | sc-8036 | |
| 山羊抗小鼠IgG抗体（HRP标记） | ImmunoReagents | GtxMu-003-DHRPX | |
| 重组寨卡病毒EDIII His标签蛋白 | Sino Biological US | 40543-V08Y | |
| ECL底物Radiance Q | Azure Biosystems | -- | |
| 蛋白定量 | ImageJ软件 | NIH | -- |
| 电镜 | FEI Talos F200X透射电子显微镜 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 动物免疫 | AddaVax佐剂 | InvivoGen | vac-adx-10 |
| 中和试验 | OptiMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 复制子质粒pWNVII-Rep-G-Z | 文中未明确说明 | -- | |
| 包装质粒POWV C-prM-E | 文中未明确说明 | -- | |
| Vero细胞 | ATCC | CCL-81™ | |
| EMEM培养基 | ATCC | 30-2003™ | |
| 细胞培养 | 293T细胞 | ATCC | CRL-3216™ |
| ELISA | Costar ELISA板 | Corning Inc. | -- |
| HRP标记的抗小鼠IgG或IgG亚型抗体 | Bio-Rad Laboratories | -- | |
| EnVision酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 杂交瘤 | ClonaCell-HY杂交瘤试剂盒 | Stemcell Technologies | #03800 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达 | 毕赤酵母表达系统，POWV EDIII蛋白序列（残基301-401），C端八组氨酸标签，镍亲和色谱纯化 阅读提示：Materials and Methods第4.1节 |
| POW-VLP生产 | 293T细胞，质粒pD2529-CMV-03（CMV启动子），prM-E基因（POWV LB株），转染试剂Lipofectamine 3000，转染后72小时收集，超速离心和蔗糖梯度纯化 阅读提示：Materials and Methods第4.2节 |
| 动物免疫 | BALB/c小鼠，6周龄，每组10只（5雄5雌），剂量1、5、10 μg EDIII等效抗原，免疫时间第1、21、42天，肌肉注射，AddaVax佐剂1:1混合，血清采集时间 阅读提示：Materials and Methods第4.7节 |
| ELISA检测 | 包被抗原POWV EDIII蛋白（NR-52391）25 ng/孔，血清稀释，HRP标记抗鼠IgG和IgG亚型抗体，终点滴度定义，阳性对照 阅读提示：Materials and Methods第4.8节 |
| 中和试验 | 报告病毒颗粒系统（复制子pWNVII-Rep-G-Z和包装质粒POWV C-prM-E），293T细胞转染，Vero细胞滴定，血清稀释，PRNT50计算 阅读提示：Materials and Methods第4.9节 |
| 单克隆抗体制备 | 免疫小鼠脾细胞，ClonaCell-HY试剂盒，ELISA和点印迹筛选 阅读提示：Materials and Methods第4.10节 |