TurboID邻近标记实验
鉴定SARS-CoV-2蛋白的邻近人类蛋白质组
将29个病毒蛋白与TurboID融合，在HEK293T细胞中表达，加入生物素10分钟，富集生物素化肽段，通过LC-MS/MS鉴定。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
基于抗体的邻近标记图谱揭示SARS-CoV-2抑制抗病毒免疫的机制
An antibody-based proximity labeling map reveals mechanisms of SARS-CoV-2 inhibition of antiviral immunity.
实验完整度
高包含TurboID邻近标记筛选、功能验证（假病毒进入、IFN报告基因、VSV复制）、机制验证（co-IP、突变体、敲低）及SARS-CoV-2活病毒感染实验，证据层级多。
主要模型
HEK293T细胞 HEK293T-hACE2细胞 HeLa-hACE2细胞 Vero E6细胞
重点核对
TurboID融合蛋白在HEK293T细胞中的表达（抗Myc抗体检测） ITGB1与hACE2共表达增强SARS-CoV-2假病毒进入 ITGB1敲低（siRNA）显著降低SARS-CoV-2复制 NSP9抑制STAT1磷酸化依赖于SETD2 MAVS敲除增加SARS-CoV-2复制
摘要
由冠状病毒严重急性呼吸综合征冠状病毒2型（SARS-CoV-2）引起的全球疫情已导致超过2亿人感染。为了扩展对SARS-CoV-2与人类相互作用的知识，我们通过使用基于抗体的TurboID实验系统地研究了人类细胞中29种病毒蛋白的相互作用组。共鉴定出1,388个具有生物素化位点的高置信度人类邻近蛋白。值得注意的是，我们发现SARS-CoV-2操纵抗病毒和免疫反应。我们验证了膜蛋白ITGB1与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合以介导SARS-CoV-2进入。此外，我们揭示SARS-CoV-2蛋白通过线粒体蛋白线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）和甲基转移酶SET结构域含2、组蛋白赖氨酸甲基转移酶（SETD2）抑制干扰素通路的激活。我们提出了111种用于冠状病毒病2019（COVID-19）临床治疗的潜在药物，并鉴定了三种显著抑制SARS-CoV-2复制的化合物。SARS-CoV-2与人类的邻近标记图谱为阐明病毒感染机制和开发COVID-19治疗药物提供了资源。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2蛋白与人类宿主蛋白的相互作用图谱及其对抗病毒免疫的调控机制。
- 核心机制
- SARS-CoV-2蛋白通过ITGB1介导病毒进入；通过MAVS抑制干扰素通路；NSP9通过SETD2抑制STAT1磷酸化和核转位；NSP14和NSP16通过Hippo通路阻断干扰素信号。
- 主要证据
- TurboID邻近标记鉴定1,388个高置信度邻近蛋白；co-IP验证相互作用；IFN-β/λ1报告基因和VSV-eGFP复制实验验证功能；MAVS敲除细胞和SARS-CoV-2感染实验支持MAVS关键作用；NSP9敲低SETD2和突变体实验证明SETD2依赖性。
- 研究意义
- 提供SARS-CoV-2与人类互作组图谱，揭示病毒抑制免疫的机制，提出潜在药物靶点，为治疗COVID-19提供资源。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
ITGB1介导SARS-CoV-2进入验证
验证ITGB1是否作为SARS-CoV-2进入的共受体
通过co-IP验证ITGB1与S蛋白和hACE2的结合；在HEK293T细胞中共表达ITGB1和hACE2，感染SARS-CoV-2假病毒；在HEK293T-hACE2细胞中梯度增加ITGB1；使用ITGB1抗体阻断；在HeLa-hACE2细胞中敲低ITGB1后感染SARS-CoV-2。
病毒蛋白抑制MAVS介导的IFN通路验证
验证SARS-CoV-2蛋白是否通过MAVS抑制IFN通路
co-IP验证病毒蛋白与MAVS结合；共转染病毒蛋白和MAVS，检测IFN-β/λ1报告基因活性；利用VSV-eGFP复制实验检测IFN抗病毒效果；使用MAVS敲除细胞感染SARS-CoV-2比较病毒复制和ISG表达。
NSP9通过SETD2抑制STAT1信号验证
验证NSP9是否通过SETD2抑制STAT1磷酸化和核转位
co-IP验证NSP9与SETD2结合；过表达NSP9和SETD2，检测hIFN-α刺激下的STAT1磷酸化；敲低SETD2或使用SETD2突变体观察STAT1磷酸化恢复；用共聚焦显微镜观察STAT1核转位；RT-qPCR检测ISG56表达。
NSP14和NSP16通过Hippo通路阻断IFN信号验证
验证NSP14和NSP16是否通过Hippo通路抑制IFN信号
co-IP验证NSP14/NSP16与TJP1结合；检测TBK1诱导的IRF3磷酸化水平；检测IFN-β和ISG56的表达；SeV刺激下检测IFN-β和ISG56表达。
药物筛选与抗病毒验证
从邻近标记图谱中预测潜在药物并验证其抗SARS-CoV-2活性
基于DrugBank和Connectivity Map分析靶向邻近蛋白的药物；选择12种化合物在Vero E6细胞中测试抗病毒活性；检测病毒N mRNA和细胞活力。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| TurboID邻近标记 | TurboID | -- | -- |
| Western blot | 抗生物素抗体 | ImmuneChem | ICP0615 |
| 抗Myc抗体 | MBL Life Science | M047-3 | |
| 抗Flag抗体 | MBL Life Science | M185-3L | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| 抗磷酸化STAT1-Y701抗体 | Abcam | ab29045 | |
| 抗H3K36me3抗体 | Cell Signaling Technology | 4909 | |
| 抗MAVS抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-166583 | |
| 抗ITGB1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | SC-374429 | |
| 抗STAT1抗体 | Beyotime Biotechnology | AF2512 | |
| 抗IRF3抗体 | Beyotime Biotechnology | AF2485 | |
| 抗磷酸化IRF3-S386抗体 | Beyotime Biotechnology | AF1594 | |
| 抗SETD2抗体 | Abclonal | A3194 | |
| 抗GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences | -- |
| Lipofectamine RNAiMax | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TurboID邻近标记 | 生物素 | -- | -- |
| 蛋白消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 质谱分析 | Q-Exactive HF-X质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| UltiMat 3000 RSLCnano系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 蛋白定量 | BCA法 | -- | -- |
| 双荧光素酶报告基因 | 双荧光素酶报告基因检测试剂盒 | Vazyme | DL101-01 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒 | Yeasen | 40203ES60 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | KAPA SYBR FAST qPCR预混液 | Kapa Biosystems | -- |
| ReverTra qPCR逆转录预混液 | TOYOBO | FSQ-301 | |
| 抗病毒实验 | 阿扎胞苷 | Selleck | S1782 |
| 硫柳汞 | Selleck | S3646 | |
| 维替泊芬 | Selleck | S1786 | |
| 瑞德西韦 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TurboID邻近标记 | 病毒蛋白克隆载体和标签位置；转染时间；生物素浓度和标记时间；细胞裂解和质谱流程 阅读提示：STAR Methods: Proximity labelling with TurboID assays, Mass spectrometry analysis |
| ITGB1功能验证 | ITGB1和hACE2共表达条件；假病毒制备和感染条件；抗体浓度；siRNA序列和转染条件 阅读提示：Figure 4 legends, STAR Methods: Pseudovirus production, RNA interference |
| MAVS介导的IFN通路验证 | 病毒蛋白和MAVS共转染条件；报告基因检测时间；VSV-eGFP感染MOI；MAVS敲除细胞构建 阅读提示：Figure 5 legends, STAR Methods: Dual-luciferase reporter assays, Viral infection and plaque assays |
| NSP9-SETD2通路验证 | hIFN-α刺激浓度和时间；SETD2敲低和突变体条件；STAT1磷酸化检测；核转位定量方法 阅读提示：Figure 6 legends, STAR Methods: Co-immunoprecipitation and western blot assays, Fluorescence microscopy |
| 抗病毒药物筛选 | Vero E6细胞密度；药物预处理时间；浓度梯度；病毒MOI；检测时间点 阅读提示：Figure 7 legends, STAR Methods: Anti SARS-CoV-2 infection assays by the selected compounds |