刺突介导的细胞融合实验
测试HNP1和RC-101是否能干扰SARS-CoV-2刺突与ACE2的相互作用。
将表达刺突和mCherry的U2OS细胞与表达ACE2的Calu-3细胞共培养，加入或不加防御素，观察合胞体形成。
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人防御素HNP1和Retrocyclin RC-101抑制SARS-CoV-2感染。
Inhibition of SARS-CoV-2 Infection by Human Defensin HNP1 and Retrocyclin RC-101.
实验完整度
高包括细胞融合实验、假病毒感染、真病毒BSL-3感染、荧光各向异性结合实验、DSF稳定性实验、沉淀实验和SPR结合的体外磷酸化实验，涵盖体外和细胞水平验证。
主要模型
U2OS细胞 Calu-3细胞 H1299细胞 Vero E6细胞
重点核对
Sypro Orange染料浓度（1:5000稀释）
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒（SARS-CoV）-2是一种包膜病毒，是COVID-19大流行的病原体。新出现的可能更具传染性和疫苗耐药性的SARS-CoV-2变体是一个持续的威胁。因此，更好地了解能够抑制病毒的先天免疫机制仍然至关重要。先天免疫系统的一个组成部分是具有广泛抗病原体（包括抗病毒）活性的阳离子免疫肽家族，称为防御素。防御素中和包膜和非包膜病毒以及灭活多种细菌毒素的能力与其促进具有高构象可塑性蛋白质去折叠的能力相关。我们发现人中性粒细胞α-防御素HNP1以亚微摩尔亲和力结合SARS-CoV-2刺突蛋白，其亲和力比其与血清白蛋白的结合强20倍以上。因此，HNP1以及θ-防御素retrocyclin RC-101都能干扰刺突介导的膜融合、刺突假型慢病毒感染以及细胞培养中真实SARS-CoV-2的感染。这些效应与防御素使刺突蛋白去稳定和沉淀以及抑制刺突与ACE2受体相互作用的能力相关。血清降低HNP1的抗SARS-CoV-2活性，但在高浓度下，HNP1即使在血清存在下也能灭活病毒。总的来说，我们的结果表明防御素可以负面影响SARS-CoV-2刺突的天然构象，α-和θ-防御素可能是开发SARS-CoV-2感染预防策略的有价值工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- α-防御素HNP1和θ-防御素retrocyclin RC-101是否及如何抑制SARS-CoV-2感染
- 核心机制
- HNP1和RC-101结合SARS-CoV-2刺突蛋白，诱导其去折叠和沉淀，从而抑制刺突与ACE2受体的相互作用。
- 主要证据
- HNP1与刺突蛋白的亲和力Kd为146±18 nM，显著高于与BSA的结合；DSF显示刺突蛋白去稳定化；沉淀实验显示刺突蛋白部分沉淀；细胞融合、假病毒和真实病毒感染均被抑制。
- 研究意义
- 防御素可能成为开发SARS-CoV-2感染预防策略的有用工具，特别是作为局部抗病毒制剂，如鼻腔应用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
假病毒感染实验
验证防御素对刺突假型病毒的感染抑制作用，并确定是否靶向病毒粒子。
H1299细胞感染SARS-CoV-2刺突假型慢病毒，检测Nluc报告基因活性。比较防御素预处理细胞或预处理病毒的效果。
结合亲和力测定
直接检测HNP1与刺突蛋白的结合亲和力及选择性。
使用荧光各向异性检测Cy5标记的HNP1与不同浓度刺突蛋白或BSA的结合，拟合结合等温线。
蛋白质稳定性分析和沉淀实验
检测防御素对刺突蛋白稳定性的影响及是否诱导沉淀。
使用DSF检测刺突蛋白在防御素存在下的熔化温度变化；超速离心后SDS-PAGE分析可溶和沉淀部分。
刺突/ACE2固相结合实验
检测防御素是否抑制刺突与ACE2的结合。
将生物素化ACE2包被在链霉亲和素板上，预孵育刺突与防御素后加入，用抗S2抗体检测结合。
真实SARS-CoV-2感染实验
评估防御素对真实病毒的抑制作用，并计算IC50。
Vero E6细胞感染SARS-CoV-2，用流式检测核蛋白阳性细胞。病毒预处理或直接加入防御素。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| RPMI-1640培养基 | -- | -- | |
| EMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 细胞融合实验 | Hoechst 33342染料 | Invitrogen | -- |
| 荧光各向异性 | Cy5标记的HNP1 | -- | -- |
| DSF | Sypro Orange染料 | Invitrogen | -- |
| CFX实时PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 沉淀实验 | TLA-100转子 | Beckman Coulter | -- |
| Optima MAX-TL超速离心机 | Beckman Coulter | -- | |
| 固相结合实验 | NeutrAvidin | ThermoFisher Scientific | #31000 |
| 生物素化ACE2 | R&D Systems | #BT933-020 | |
| 抗刺突S2亚基抗体 | R&D Systems | #MAB10557 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠抗体 | Sigma | #A4416 | |
| 假病毒生产 | Fugene 6转染试剂 | Promega | -- |
| 假病毒检测 | NanoGlo荧光素酶检测系统 | Promega | -- |
| SARS-CoV-2感染 | 抗SARS-CoV-2核蛋白抗体 | Sino Biological | #40143-MM08 |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 647二抗 | Life Technologies | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 刺突介导的细胞融合实验 | U2OS细胞共转染Spike和mCherry，与Calu-3细胞共培养，加入40 µM防御素，无血清或10% FBS，共培养24小时。 阅读提示：Figure 1(A-D)和图注 |
| 假病毒感染实验 | H1299细胞感染Spike假型病毒，防御素预处理病毒或细胞，浓度50 µM，无血清或10% FBS，感染后24小时检测荧光素酶。 阅读提示：Figure 2(A-E)和图注 |
| 荧光各向异性 | Cy5-HNP1浓度50 nM，Spike或BSA浓度梯度，在PBS中，测定结合常数。 阅读提示：Figure 3(A,B)和Methods |
| DSF | Spike蛋白浓度1 μM（单体），防御素浓度无或HNP1/RC-101，Sypro Orange稀释1:5000，PBS中。 阅读提示：Figure 3(C,D)和Methods |
| 沉淀实验 | Spike蛋白浓度1 μM，防御素浓度12 μM，30分钟37°C，超速离心100,000g 30分钟，SDS-PAGE分析。 阅读提示：Figure 3(E)和Methods |
| 固相结合实验 | ACE2包被浓度2 μg/mL，Spike预孵育1小时37°C，防御素浓度梯度。 阅读提示：Figure 3(F,G)和Methods |
| 真实病毒感染 | Vero E6细胞，MOI=1，防御素预处理或不预处理，浓度50 µM或IC50测定，血清有无，感染24小时后流式检测。 阅读提示：Figure 4和Figure 5及图注 |