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        自噬机制因子对HCV和SARS-CoV-2复制细胞器形成的贡献

        Contribution of autophagy machinery factors to HCV and SARS-CoV-2 replication organelle formation.

        作者信息Woan-Ing Twu, Ji-Young Lee, Heeyoung Kim, Vibhu Prasad, Berati Cerikan, Uta Haselmann, Keisuke Tabata, Ralf Bartenschlager
        PMID34788596
        期刊Cell Rep
        发布时间2021-11-23
        DOI10.1016/j.celrep.2021.110049
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        包含ATG5/ATG16L1敲除、药物抑制、siRNA敲低、PI3P生物传感器、透射电镜和关联光电镜等多层级验证。

        主要模型

        Huh7-Lunet/T7细胞 Huh7-Lunet/T7/ACE2细胞 A549/ACE2细胞 Calu-3细胞

        重点核对

        HCV使用JcR2a报告病毒（MOI 0.1），SARS-CoV-2使用Bavpat1/2020分离株（MOI 1） PIK-III浓度：HCV EC50约320 nM，SARS-CoV-2 EC50约170 nM ATG5和ATG16L1敲除通过CRISPR-Cas9在Huh7-Lunet/T7细胞中实现 siRNA敲低VPS34、Beclin 1、DFCP1使用Lipofectamine RNAiMAX，两次转染间隔24 h

        摘要

        Twu等人研究了自噬机制组分在HCV和SARS-CoV-2复制中的作用。常规巨自噬对这两种病毒的复制都不是必需的。然而，参与自噬体形成的因子，包括III类PI3K复合物的组分，有助于病毒复制。它们很可能促进膜性复制细胞器的形成。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        自噬机制因子是否以及如何参与HCV和SARS-CoV-2复制细胞器的形成？
        核心机制
        HCV和SARS-CoV-2利用自噬体形成早期的因子，特别是III类PI3K复合物产生PI3P，招募DFCP1，促进DMV形成，而常规巨自噬（ATG5-12/16L1依赖）并非必需。
        主要证据
        ATG5/ATG16L1敲除不影响病毒复制；PIK-III抑制或VPS34/Beclin 1敲低降低复制和DMV形成；PI3P传感器显示感染细胞中PI3P增加；DFCP1敲低降低复制和DMV形成。
        研究意义
        揭示了进化上不同的病毒趋同利用宿主自噬机制因子，可能为开发广谱抗病毒药物提供靶点。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        验证巨自噬非必需

        确定ATG5-12/16L1依赖的巨自噬是否对HCV和SARS-CoV-2复制必需

        在Huh7-Lunet/T7细胞中通过CRISPR-Cas9敲除ATG5和ATG16L1，验证自噬抑制，并检测病毒复制。

        2

        抑制III类PI3K活性

        测试III类PI3K活性对HCV和SARS-CoV-2复制的影响

        使用VPS34特异性抑制剂PIK-III处理感染细胞，或通过siRNA敲低VPS34/Beclin 1，测量病毒复制。

        3

        检测PI3P产生

        确定HCV和SARS-CoV-2感染是否增强PI3P产生

        使用GFP-DFCP1生物传感器稳定表达细胞，感染或表达病毒蛋白，通过荧光显微镜计数DFCP1斑点。

        4

        评估DMV形成

        确定PI3P和DFCP1是否影响病毒蛋白诱导的DMV形成

        在药物处理或DFCP1敲低后，利用透射电镜或关联光电镜计数DMV。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        验证自噬抑制
        蛋白质印迹免疫荧光
        验证病毒复制
        荧光素酶报告基因检测实时定量PCR免疫染色
        验证PI3P产生
        基于生物传感器的成像
        评估DMV形成
        透射电子显微镜关联光电子显微镜
        基因敲除/敲低
        CRISPR-Cas9基因敲除siRNA基因敲低

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        Western blotAtg5 (D5F5U)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology12994
        Atg16L1 (D6D5)兔单克隆抗体Cell Signaling Technology8089
        抗LC3多克隆抗体MBL InternationalPM036
        免疫荧光抗PI4P纯化IgM抗体Echelon BiosciencesZ-P004
        Western blotIII类PI3激酶抗体 (VPS34)Cell Signaling Technology3811
        Beclin-1抗体Cell Signaling Technology3738
        免疫染色SARS-CoV-2 N蛋白抗体Sino Biological40143-MM05
        免疫荧光抗SARS Nsp3抗体Abcamab181620
        Western blot小鼠单克隆抗NS5A抗体 (9E10)Gift from C. M. RiceN/A
        抗HA单克隆抗体Sigma AldrichH3663
        ZFYVE1 (DFCP1)多克隆抗体Thermo Fisher ScientificPA5-96710
        GAPDH (D16H11) XP®兔单克隆抗体Cell Signaling Technology5174S
        山羊抗小鼠HRP多克隆抗体Sigma AldrichA0168
        山羊抗兔HRP多克隆抗体Sigma AldrichSAB3700852
        免疫荧光Alexa Fluor® 488标记驴抗兔二抗Thermo Fisher ScientificA21206
        Alexa Fluor® 488标记驴抗小鼠二抗Thermo Fisher ScientificA21202
        Alexa Fluor® 568标记驴抗小鼠二抗Thermo Fisher ScientificAA10037
        Alexa Fluor® 488标记山羊抗小鼠IgM二抗Thermo Fisher ScientificA21042
        DAPIThermo Fisher ScientificD1306
        药物处理达卡他韦MedChemExpressHY-10466
        巴弗洛霉素A1Sigma AldrichB1793
        PI4KA-G1Gift from V. LohmannN/A
        PIK-IIICayman Chemical17002
        瑞德西韦MedChemExpressHY-104077
        细胞培养Earle平衡盐溶液Sigma AldrichE2888
        细胞活力检测CellTiter-Glo®发光细胞活力检测试剂盒PromegaG7571
        质粒转染TransIT®-LT1转染试剂Mirus BiologyMIR2306
        siRNA转染Lipofectamine® RNAiMAX转染试剂Thermo Fisher Scientific13778
        分子克隆Gateway LR Clonase II酶混合物Thermo Fisher Scientific11791100
        In-Fusion® HD克隆试剂盒Clontech Laboratories639650
        RNA提取NucleoSpin RNA提取试剂盒Machery-Nagel740955
        cDNA合成High-Capacity cDNA逆转录试剂盒Thermo Fisher Scientific4368814
        qPCRiTaq Universal SYBR green预混液BioRad1725121

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        细胞培养
        细胞系（Huh7-Lunet/T7，A549/ACE2等），培养基（DMEM cplt），抗生素（G418、zeocin），饥饿处理（EBSS 2 h）
        阅读提示：STAR Methods, Cell lines and culture conditions
        ATG敲除
        sgRNA靶序列，筛选抗生素浓度（嘌呤霉素3 μg/ml），敲除验证（Western blot）
        阅读提示：STAR Methods, Lentivirus production and establishment of stable cell lines; 图1C
        药物处理
        PIK-III浓度（HCV 1 μM；SARS-CoV-2 1 μM），处理时间（HCV 2 h；SARS-CoV-2 20 h），DMSO对照
        阅读提示：图3, 图4; STAR Methods, SARS-CoV-2-replication assay
        siRNA敲低
        siRNA序列，转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX），转染次数（两次），间隔（24 h）
        阅读提示：STAR Methods, siRNA-based knockdown
        病毒复制检测
        HCV MOI 0.1，SARS-CoV-2 MOI 1，检测时间点（24 h），qRT-PCR引物序列（ORF1，HPRT）
        阅读提示：图1, 图2; STAR Methods, HCV replication assay, qRT-PCR-based SARS-CoV-2-replication assay
        DMV定量
        TEM样品制备，分析面积（100 μm²），细胞数量（DMSO 13-15，PIK-III 46-49）
        阅读提示：图4, 图6; STAR Methods, Transmission electron microscopy

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