样本验证
验证所购S1蛋白的纯度和身份
对三种S1蛋白进行酶解，使用LC-MS/MS进行蛋白质组学分析，并通过MaxQuant鉴定蛋白。
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MERS-CoV、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2刺突糖蛋白1的N-聚糖及其异构体的直接比较
Direct Comparison of N-Glycans and Their Isomers Derived from Spike Glycoprotein 1 of MERS-CoV, SARS-CoV-1, and SARS-CoV-2.
实验完整度
中包含样本验证蛋白质组学、N-聚糖组学实验，以及LC-MS/MS分析，但缺乏功能验证或机制验证。
主要模型
MERS-CoV S1蛋白（HEK293细胞表达） SARS-CoV-1 S1蛋白（HEK293细胞表达） SARS-CoV-2 S1蛋白（HEK293细胞表达）
重点核对
蛋白来源：SARS-CoV-2 S1和MERS-CoV S1购自Sino Biological，SARS-CoV-1 S1购自Acro Biosystems 表达细胞系：HEK293细胞 实验重复数：3次 酶处理：α2-3神经氨酸酶S和α1-3,4岩藻糖苷酶 色谱柱：200cm μPAC™柱（PharmaFluidics）
摘要
COVID-19大流行的出现使全球科学界致力于快速开发有效的治疗方法和疫苗。由于刺突（S）糖蛋白在入侵宿主细胞中的关键作用，它是这些研究的主要靶点之一。刺突蛋白的S1亚基包含受体结合域（RBD），该结构域使病毒能够初始结合宿主细胞。作为一种高度糖基化的蛋白质，许多研究已经调查了其聚糖组成。然而，没有研究探索该蛋白质的异构体聚糖分布。此外，这种异构体聚糖分布从未与导致过去流行的冠状病毒SARS-CoV-1和MERS-CoV进行比较。本研究使用LC-MS/MS探索了冠状病毒S1蛋白中异构体聚糖分布的未开发领域。我们相信我们的数据将有助于未来研究异构体聚糖在冠状病毒病毒发病机制中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MERS-CoV、SARS-CoV-1和SARS-CoV-2的刺突蛋白S1亚基的N-聚糖及其异构体分布是否存在差异？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过LC-MS/MS分析三种冠状病毒S1蛋白的N-聚糖，发现SARS-CoV-2 S1具有更高的复杂型聚糖、唾液酸化和岩藻糖基化水平，且多种聚糖异构体分布存在差异。
- 研究意义
- 作者认为数据有助于未来研究异构体聚糖在冠状病毒发病机制中的作用，并强调对天然病毒刺突蛋白进行异构体聚糖分析对于疫苗开发和快速检测策略的必要性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
N-聚糖释放
从S1蛋白中释放N-聚糖
采用顺序过滤辅助N-糖组学方法，包括变性、酶解（α2-3神经氨酸酶或α1-3,4岩藻糖苷酶）和PNGase F释放N-聚糖。
聚糖还原和甲基化
衍生化聚糖以增强检测和分离
使用硼烷-氨还原和氢氧化钠珠固相甲基化处理释放的聚糖。
LC-MS/MS分析
分离和鉴定N-聚糖及其异构体
使用纳升液相色谱高分辨质谱对衍生化聚糖进行分离和分析，包括使用200cm μPAC™柱进行异构体分离。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本验证蛋白质组学 | 碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | -- |
| 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 胰蛋白酶/Lys-C | Promega | -- | |
| N-聚糖释放 | 高效液相色谱级水 | Avantor Performance Materials | -- |
| 10k截留分子量过滤装置 | MilliporeSigma | -- | |
| Sorvall Legend Micro 21离心机 | Thermo Scientific | -- | |
| α2-3神经氨酸酶S | New England Biolabs | -- | |
| α1-3,4岩藻糖苷酶 | New England Biolabs | -- | |
| PNGase F | New England Biolabs | -- | |
| Labconco CentriVap台式真空浓缩仪 | Labconco | -- | |
| 聚糖还原和甲基化 | 甲醇 | Fisher Scientific | -- |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | -- | |
| 空离心柱 | Harvard Apparatus | -- | |
| LC-MS/MS分析（样品验证） | Ultimate 3000纳升液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| Q-Exactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| C18捕集柱（Acclaim PepMap 100） | Thermo Scientific | -- | |
| C18毛细管柱（Acclaim PepMap 100） | Thermo Scientific | -- | |
| LC-MS/MS分析（聚糖） | Ultimate 3000纳升液相色谱系统 | Thermo Scientific | -- |
| LTQ Velos Orbitrap质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 200cm μPAC™柱 | PharmaFluidics | -- | |
| μPAC™捕集柱 | PharmaFluidics | -- | |
| 数据处理 | MaxQuant | -- | -- |
| Skyline | -- | -- | |
| XCalibur Qual Browser 4.3 | Thermo Scientific | -- | |
| GlycoWorkbench 2 | -- | -- | |
| GraphPad Prism 8.4.3 | -- | -- | |
| biorender.com | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白样本获取 | 来源：SARS-CoV-2 S1 (Sino Biological 40591-V08H), MERS-CoV S1 (Sino Biological 40069-V08H), SARS-CoV-1 S1 (Acro Biosystems S1N-S52H5)；表达细胞系：HEK293 阅读提示：Methods: Spike protein 1 acquisition |
| 样本验证蛋白质组学 | 还原、烷基化、酶解条件：DTT浓度、IAA浓度、酶与蛋白比例、温度和时间；重复数：3 阅读提示：Methods: Sample validation proteomics experiment |
| N-聚糖释放 | 蛋白量：5 μg；变性温度和时间：90°C 20分钟；过滤装置：10k MWCO；酶解：α2-3神经氨酸酶S 40单位或α1-3,4岩藻糖苷酶20单位，37°C 18小时；PNGase F 500单位，37°C 18小时 阅读提示：Methods: Sequential Filter-Aided N-glycomics |
| 聚糖还原和甲基化 | 还原条件：硼烷-氨浓度、温度和时间；甲基化：氢氧化钠珠、DMSO、碘甲烷体积和时间 阅读提示：Methods: Glycan Reduction and Permethylation |
| LC-MS/MS分析 | 仪器：纳升液相色谱、质谱仪型号；色谱柱：200cm μPAC™；进样量：1 μg；梯度洗脱程序；质谱参数：分辨率、扫描范围、碰撞能量 阅读提示：Methods: LC-MS/MS Analysis |