LYSMD3表达定位
确定LYSMD3在人呼吸道上皮细胞中的亚细胞定位，验证其表面表达。
通过生化分离和细胞表面蛋白生物素化，免疫印迹检测LYSMD3在BEAS-2B和A549细胞膜和胞质部分的表达。
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LYSMD3：哺乳动物对几丁质的模式识别受体
LYSMD3: A mammalian pattern recognition receptor for chitin.
实验完整度
高包含体外结合实验（ELISA、pull-down）、细胞功能实验（siRNA/CRISPR敲低或敲除、细胞因子检测）、竞争抑制实验及真菌结合实验等多种证据层级，且具有明确的功能和机制验证。
主要模型
人支气管上皮细胞（BEAS-2B） 人肺泡上皮细胞（A549） 原代人支气管上皮细胞（NHBE） 小鼠巨噬细胞（RAW 264.7）
重点核对
LYSMD3在BEAS-2B和A549细胞膜上的表达定位（免疫印迹、细胞表面生物素化） LYSMD3与几丁质寡糖（DP5-7）及几丁质磁珠的结合能力（ELISA、pull-down） LYSMD3与白色念珠菌和链格孢霉的结合（真菌结合实验） siRNA或CRISPR-Cas9敲低/敲除LYSMD3对几丁质诱导的IL-6和IL-8产生的影响 可溶性LYSMD3胞外域或抗LYSMD3抗体对几丁质诱导的IL-8产生的竞争性抑制
摘要
几丁质是真菌细胞壁的主要成分，与哮喘等过敏性疾病有关。然而，目前尚不清楚哺乳动物如何识别几丁质，以及上皮细胞上感知几丁质的主要受体仍未确定。在本研究中，我们表明 LYSMD3 表达于人呼吸道上皮细胞表面，并证明 LYSMD3 能够结合几丁质以及真菌细胞壁上的 β-葡聚糖。敲低或敲除 LYSMD3 也会急剧减弱上皮细胞对几丁质和真菌孢子反应产生的炎症细胞因子。通过可溶性 LYSMD3 蛋白、多种配体或针对 LYSMD3 的抗体对 LYSMD3 胞外域进行竞争性抑制，也会阻断几丁质信号传导。我们的研究揭示了 LYSMD3 是几丁质的哺乳动物模式识别受体（PRR），并确立了其在上皮细胞对几丁质和真菌的炎症反应中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 哺乳动物上皮细胞如何识别几丁质以及介导对几丁质和真菌的炎症反应？
- 核心机制
- LYSMD3作为模式识别受体直接结合几丁质和β-葡聚糖，介导上皮细胞对几丁质和真菌的炎症细胞因子产生。
- 主要证据
- LYSMD3在肺上皮细胞表面表达，直接结合几丁质和真菌（如白色念珠菌和链格孢霉）；敲低或敲除LYSMD3抑制几丁质和真菌诱导的IL-6、IL-8产生；可溶性LYSMD3胞外域或抗LYSMD3抗体阻断几丁质信号。
- 研究意义
- 该研究揭示了LYSMD3作为哺乳动物几丁质受体，为理解真菌过敏和哮喘等气道炎症疾病提供了新的分子机制。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
LYSMD3与几丁质的结合
验证LYSMD3是否直接结合几丁质及其寡糖。
ELISA检测LYSMD3胞外域与固定化几丁质寡糖（DP5-7）的结合；pull-down实验检测与几丁质磁珠的结合；竞争实验验证特异性。
LYSMD3与真菌细胞的结合
检验LYSMD3是否识别真菌细胞壁上的几丁质和β-葡聚糖。
将重组LYSMD3与热灭活白色念珠菌或活链格孢霉孢子孵育，通过免疫印迹检测结合。
LYSMD3介导细胞因子产生
评估LYSMD3对几丁质和真菌诱导的炎症反应的贡献。
siRNA敲低或CRISPR-Cas9敲除LYSMD3后，用几丁质寡糖、几丁质颗粒、链格孢霉孢子等刺激，ELISA检测IL-6、IL-8和IL-33等细胞因子分泌。
拮抗LYSMD3功能
验证阻断LYSMD3能否抑制几丁质诱导的反应，并排除其他受体参与。
使用可溶性LYSMD3胞外域或抗LYSMD3抗体预处理细胞，或用β-葡聚糖等竞争配体，检测IL-8分泌或NF-κB活性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证结合活性
验证功能变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | 抗LYSMD3抗体 | Proteintech | 24313-1-AP |
| 抗HSP90抗体 | Proteintech | 13171-1-AP | |
| 抗钠钾ATP酶抗体（HRP） | Abcam | ab185065 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 | |
| 小鼠IgG2B同型对照抗体 | R&D | MAB004 | |
| 抗人TLR2抗体 | R&D | AF2616 | |
| 抗人TLR4抗体 | R&D | MAB1478 | |
| 抗人Dectin-1抗体 | R&D | MAB1859 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab13970 | |
| 兔IgG同型对照抗体 | Thermo Fisher Scientific | 31235 | |
| 抗6x-His标签抗体（HRP） | Thermo Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| IgA2同型对照 | InvivoGen | maba2-ctrl | |
| 抗人TLR2-IgA抗体 | InvivoGen | maba2-htlr2 | |
| 小鼠抗兔IgG抗体（HRP） | GenScript | A01827 | |
| 刺激物 | 几丁质寡糖DP2 | Elicityl | CAS: |
| 几丁质寡糖DP3 | Elicityl | CAS: | |
| 几丁质寡糖DP4 | Elicityl | CAS: | |
| 几丁质寡糖DP5 | Elicityl | CAS: | |
| 几丁质寡糖DP6 | Elicityl | CAS: | |
| 几丁质寡糖DP7 | Elicityl | CAS: | |
| 壳七糖 | IsoSep | CAS: | |
| 虾壳几丁质 | Sigma-Aldrich | CAS: | |
| 结合实验 | 几丁质磁珠 | NEB | E8036S |
| 刺激物 | 超纯LPS-EB | InvivoGen | tlrl-3pelps |
| 超纯LPS-RS | InvivoGen | tlrl-prslps | |
| Pam3CSK4 | InvivoGen | CAS: | |
| 超纯FLA-ST | InvivoGen | tlrl-epstfla | |
| Poly(I:C) 高分子量 | InvivoGen | CAS: | |
| 海带多糖 | InvivoGen | CAS: | |
| 可溶性全葡聚糖颗粒 | InvivoGen | tlrl-wgps | |
| 可得然胶 | InvivoGen | CAS: | |
| PGN-ECndss | InvivoGen | tlrl-ksspgn | |
| PGN-EK | InvivoGen | tlrl-pgnek | |
| PGN-BS | InvivoGen | tlrl-pgnb3 | |
| 检测试剂 | QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qbs |
| 刺激物 | 链格孢提取物 | Greer Laboratories | XPMID3A2.5 |
| 重组蛋白 | 重组人LYSMD3-His | Proteintech | Ag19496 |
| 重组人TLR2, CF | R&D | 2616-TR | |
| 重组人TLR4, CF | R&D | 1478-TR | |
| 重组人Dectin-1, CF | R&D | 1859-DC | |
| 重组维多利亚水母GFP-His | Sino Biological | 13105-S07E | |
| 转染试剂 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 13778 |
| HiPerFect转染试剂 | QIAGEN | 301704 | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | InvivoGen | ant-pr |
| ELISA | 人IL-6 ELISA MAX标准试剂盒 | BioLegend | 430501 |
| 小鼠IL-6 ELISA MAX标准试剂盒 | BioLegend | 431301 | |
| 人IL-8 DuoSet ELISA试剂盒 | R&D | DY208 | |
| 人IL-8 ELISA MAX标准试剂盒 | BioLegend | 431501 | |
| 人IL-33 Quantikine ELISA试剂盒 | R&D | D3300B | |
| 小鼠MCP-1 ELISA MAX标准试剂盒 | BioLegend | 432701 | |
| 人CCL5 ELISA MAX豪华试剂盒 | BioLegend | 440804 | |
| 蛋白提取 | Mem-PER Plus膜蛋白提取试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 89842 |
| 细胞表面蛋白分离试剂盒 | BioVision | K295 | |
| 细胞增殖检测 | MTT细胞增殖检测试剂盒 | Cayman Chemical | 10009365 |
| 细胞毒性检测 | Pierce LDH细胞毒性检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88953 |
| 细胞培养 | BEAS-2B细胞系 | ATCC | CRL-9609 |
| A549细胞系 | ATCC | CCL-185 | |
| RAW 264.7细胞系 | ATCC | TIB-71 | |
| NHBE细胞 | Lonza | CC-2540 | |
| A549-Dual细胞系 | InvivoGen | a549d-nfis | |
| HEK-Blue hNOD2细胞系 | InvivoGen | hkb-hnod2 | |
| hBE33细胞 | Uchida et al., 2017 | -- | |
| 真菌培养 | 白色念珠菌 | ATCC | ATCC |
| 链格孢霉 | ATCC | ATCC | |
| siRNA转染 | 对照siRNA-A | Santa Cruz Biotechnology | sc-37007 |
| LYSMD3 siRNA（人） | Santa Cruz Biotechnology | sc-91992 | |
| LYSMD3 siRNA（小鼠） | Santa Cruz Biotechnology | sc-149191 | |
| ON-TARGETplus非靶向siRNA #1 | Dharmacon | D-001810-01 | |
| ON-TARGETplus人LYSMD3 siRNA-单条 | Dharmacon | J-024521-09 | |
| CRISPR-Cas9基因敲除 | Edit-R All-in-one慢病毒sgRNA hEF1a非靶向对照 #1 | Dharmacon | VSGC11964 |
| Edit-R人LYSMD3 hEF1a All-in-one慢病毒sgRNA-1号 | Dharmacon | VSGH11936-247618492 | |
| hEF1a All-in-one慢病毒sgRNA-2号 | Dharmacon | VSGH11936-247547638 | |
| 数据分析 | Prism 8 | Graphpad | -- |
| VisionWorks 9 | Analytik Jena | -- | |
| ImageJ | National Institutes of Health | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | BEAS-2B、A549、RAW 264.7细胞购自ATCC；NHBE细胞购自Lonza；A549-Dual和HEK-Blue hNOD2购自InvivoGen；hBE33细胞如前所述。培养条件：DMEM或BEGM培养基，10% FBS，37°C，5% CO2。 阅读提示：STAR METHODS - Experimental model and subject details |
| 真菌培养 | C. albicans SC5314在YPD培养基中30°C、300 rpm培养18小时；A. alternata在土豆葡萄糖琼脂上25°C避光培养。 阅读提示：STAR METHODS - Fungal strain and growth conditions |
| LYSMD3结合实验 | ELISA：板包被几丁质寡糖（1 μg）、LPS-EB（20 μg）、curdlan/laminarin/WGP（4 μg）、BSA（5 μg）；重组LYSMD3浓度梯度；检测抗体anti-LYSMD3 1/3000，二抗1/20000。pull-down：chitin磁珠在binding buffer中与200 μg/mL蛋白孵育4°C 1小时。 阅读提示：STAR METHODS - Chitin binding assay, LYSMD3-binding ELISA |
| 细胞刺激与细胞因子检测 | BEAS-2B、NHBE、A549、RAW 264.7细胞用几丁质DP7（500 μg/mL）、几丁质颗粒（500 μg/mL）、A. alternata孢子（2×10^5/mL）、FLA-ST（300 ng/mL）、Poly(I:C）（3 μg/mL）等刺激24小时；hBE33用Alternaria提取物（200 μg/mL）刺激1小时；ELISA检测IL-6、IL-8、IL-33等。 阅读提示：STAR METHODS - ELISA |
| siRNA转染 | BEAS-2B和A549使用Lipofectamine RNAiMAX；NHBE、hBE33、RAW 264.7使用HiPerFect；质粒转染使用X-tremeGENE HP。 阅读提示：STAR METHODS - siRNA transfection |
| CRISPR-Cas9敲除 | BEAS-2B感染Edit-R慢病毒颗粒，puromycin（1 μg/mL）筛选4天。 阅读提示：STAR METHODS - CRISPR-Cas9-mediated LYSMD3 gene knockout |