构建KSHV miRNA敲除突变体感染的TIVE细胞系
建立携带单一miRNA缺失或全部miRNA缺失的潜伏感染细胞模型，以研究各miRNA功能。
利用BAC16背景的13种突变病毒（ΔmiR-K12-1至-12及Δall）感染TIVE细胞，经潮霉素筛选获得稳定细胞系，并通过qPCR和RNA-seq验证拷贝数和基因表达。
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卡波西肉瘤相关疱疹病毒microRNA突变体调节人内皮细胞癌症标志性表型差异
Kaposi's Sarcoma-associated Herpesvirus microRNA mutants modulate cancer hallmark phenotypic differences in human endothelial cells.
实验完整度
高包含体外细胞模型（TIVE）的功能表型检测（增殖、迁移、管形成、代谢）和机制验证（qRT-PCR、Western blot、凋亡检测），结合已发表靶标组和qCLASH数据。
主要模型
端粒酶永生化静脉内皮（TIVE）细胞 TIVE-LTC转化细胞系
重点核对
KSHV miRNA敲除突变体（每个缺失单一miRNA或全部miRNA） 感染复数或基因组拷贝数（约1000基因组拷贝/细胞，ΔmiR-K12-9为2000） 细胞培养条件：Medium 199培养基，20% FBS，60 μg/ml ECGF，100 μg/ml潮霉素 表型检测：增殖（MTS）、迁移（划痕）、管形成（Matrigel）、代谢（Seahorse XF96） 细胞分组：WT、各突变体、未感染对照
摘要
卡波西肉瘤（KS）是由卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）感染的内皮细胞转化所致。KSHV microRNA（miRNA）在内皮细胞肿瘤发生过程中的作用尚未完全阐明。为了更清楚地了解单个miRNA对肿瘤发生相关细胞表型的贡献，我们使用了KSHV miRNA敲除突变体，每个突变体缺失12个miRNA基因之一，另有一个突变体缺失所有miRNA。由于KSHV感染会引起内皮细胞多种表型变化，我们检测了这些突变体在感染端粒酶永生化静脉内皮（TIVE）细胞后引起此类变化的能力。评估了野生型、突变型和未感染细胞的增殖、迁移、管形成和糖酵解变化。我们发现不同病毒在这些方面存在广泛差异。在增殖率方面，ΔmiR-K12-3、ΔmiR-K12-8和ΔmiR-K12-11显著受损。感染ΔmiR-K12-11的细胞迁移能力降低。在管形成方面，ΔmiR-K12-5、-6和-7病毒存在缺陷。同时，感染ΔmiR-K12-10病毒的细胞表现出糖酵解失调。将这些观察结果与先前发表的核糖体学数据中的KSHV miRNA靶标组列表相结合，我们能够功能验证特定通路中的多个新miRNA靶标。作为概念验证，miR-K12-3被证明靶向组织蛋白酶D，这是一种强效的凋亡促进因子。综上所述，结果表明KSHV miRNAs在诱导转化细胞特征性表型变化中发挥不同作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- KSHV miRNAs在内皮细胞致癌过程中的个体贡献是什么？
- 核心机制
- 不同KSHV miRNA通过靶向特定宿主基因（如miR-K12-3靶向CTSD抑制凋亡，miR-K12-11靶向TGFβ通路促进增殖）协同诱导肿瘤相关表型。
- 主要证据
- 利用BAC16背景的miRNA敲除病毒库感染TIVE细胞，通过增殖、迁移、管形成和代谢测定发现各突变体表型差异；结合qCLASH和已发表靶标组，验证miR-K12-3靶向CTSD，并通过qRT-PCR、Western blot和annexin V测定确认。
- 研究意义
- 明确了KSHV miRNAs在诱导内皮细胞癌症相关表型中的不同作用，为理解病毒致癌机制和潜在治疗靶点提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
检测细胞增殖能力
评估不同miRNA缺失对细胞增殖的影响。
使用MTS比色法测定细胞增殖率，比较各突变体与WT的差异。
评估细胞迁移能力
评估不同miRNA缺失对细胞迁移（伤口愈合）的影响。
进行划痕实验，测量0小时和12小时划痕面积变化，使用TScratch软件分析。
测定管形成能力（血管生成替代指标）
评估不同miRNA缺失对血管生成能力的影响。
将细胞接种于Matrigel上，6和12小时后计数三根以上小管形成的连接点数量。
分析细胞代谢（糖酵解和线粒体呼吸）
评估不同miRNA缺失对Warburg效应（糖酵解和氧化磷酸化）的影响。
使用Agilent Seahorse XF96同时测量OCR和ECAR，并在特定时间点添加oxamate和rotenone抑制代谢通路。
验证miR-K12-3靶向CTSD并抑制凋亡
证明miR-K12-3通过靶向CTSD抑制细胞凋亡，作为机制验证。
利用qCLASH数据筛选靶标，通过qRT-PCR验证mRNA水平，Western blot检测蛋白水平，annexin V染色评估凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证凋亡表型
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Medium 199培养基 | Corning | 10-060-CV |
| 细胞培养添加物 | 内皮细胞生长因子 | Millipore Sigma | E2759-5X15MG |
| 细胞培养筛选 | 潮霉素 | Corning | 30-240-CR |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 细胞增殖实验 | CellTiter 96非放射性细胞增殖试剂盒 | Promega | G5421 |
| 管形成实验 | BD Matrigel基质胶 | BD | 356234 |
| 代谢测定 | Agilent Seahorse XF96分析仪 | Agilent | -- |
| 代谢测定补充物 | 葡萄糖 | Acros Organics | 41095-5000 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030 | |
| 酚红 | Acros Organics | AC611785000 | |
| 代谢测定抑制剂 | 乙醛酸 | -- | -- |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 凋亡检测试剂盒 | GFP认证凋亡/坏死检测试剂盒 | Enzo | ENZ-51002-25 |
| 凋亡检测试剂 | Alexa Fluor 647偶联的Annexin V | Thermofisher | A23204 |
| Western blot | 抗CTSD兔单克隆抗体 | Sino Biological | 12517-R010 |
| Western blot二抗 | IRDye 800CW山羊抗兔IgG | Li-Cor | 12517-R010 |
| Western blot成像 | Li-Cor成像仪 | Li-Cor | -- |
| RNA提取 | RNA-Bee试剂 | Bio-Connect | CS-501B |
| cDNA合成 | Superscript IV逆转录酶 | Invitrogen | 18090010 |
| qPCR | FastStart Essential DNA Green Master Mix | Roche | 06402712001 |
| qPCR仪器 | Roche LightCycler 96 | Roche | -- |
| DNA提取 | DNAzol试剂 | Invitrogen | 10503027 |
| RNA-seq文库制备 | NEBNext rRNA去除试剂盒 | NEB | E6350 |
| NEBNext Ultra II定向RNA文库制备试剂盒 | NEB | E7765 | |
| NEBNext多重寡核苷酸（Illumina） | NEB | E6440 | |
| RNA-seq测序平台 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| 感染辅助试剂 | 聚凝胺 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和病毒感染 | TIVE细胞培养条件（Medium 199、20% FBS、60 μg/ml ECGF、1% P/S）；感染剂量（约1000基因组拷贝/细胞，ΔmiR-K12-9为2000）；筛选浓度（50 μg/ml起始，后100 μg/ml维持） 阅读提示：Materials and Methods: Establishment of mutant-infected TIVE cell lines |
| 细胞增殖实验 | 细胞密度（5000细胞/孔）；培养时间（72小时）；MTS试剂盒品牌和货号 阅读提示：Materials and Methods: Cell proliferation assay |
| 细胞迁移实验 | 细胞密度（5×10^4细胞/孔，ΔmiR-K12-9为1×10^5）；划痕时间点（0和12小时）；TScratch软件版本 阅读提示：Materials and Methods: Wound-healing assay |
| 管形成实验 | Matrigel浓度（4 mg/ml）、体积（100 μl）；细胞密度（5×10^4细胞/孔）；拍照时间（6和12小时）；计数方法（三根以上小管连接点） 阅读提示：Materials and Methods: Tubule formation assay |
| 细胞代谢实验 | 细胞密度（2.5×10^4细胞/孔）；培养基成分（无缓冲DMEM，10 mM葡萄糖，1 mM丙酮酸，2 mM L-谷氨酰胺，15 mg/l酚红，pH 7.4）；药物浓度（oxamate 1 μM，rotenone 100 mM）及添加时间点 阅读提示：Materials and Methods: Cell metabolism assay |
| 凋亡检测 | 检测试剂盒（GFP-Certified Apoptosis/Necrosis Detection Kit）及替换试剂（Alexa Fluor 647 annexin V）；计数方法（ImageJ软件，Cy5阳性/GFP阳性比例） 阅读提示：Materials and Methods: Apoptosis assay |
| qRT-PCR | RNA提取试剂（RNA-Bee）；逆转录酶和引物（oligo(dT)）；qPCR master mix和仪器；引物序列（表2） 阅读提示：Materials and Methods: qRT-PCR |