HDL是转基因ApoA-I-/-/Bco2-/-小鼠中类胡萝卜素从肝脏到视网膜色素上皮的主要转运体

HDL is the primary transporter for carotenoids from liver to retinal pigment epithelium in transgenic ApoA-I-/-/Bco2-/- mice.

作者信息Binxing Li, Preejith Vachali, Fu-Yen Chang, Aruna Gorusupudi, Ranganathan Arunkumar, Linjia Shi, Gregory T Rognon, Jeanne M Frederick, Paul S Bernstein
PMID34942193
发布时间2022-02-15
DOI10.1016/j.abb.2021.109111

实验完整度

使用转基因小鼠模型进行体内喂养实验,结合HPLC检测类胡萝卜素分布,并通过SPR测定ApoA-I与类胡萝卜素的结合亲和力。实验包含基因敲除模型、喂养干预和组织分析,但缺乏细胞或体外功能验证,且未进行更深入的机制研究。

主要模型

ApoA-I-/-/Bco2-/-双敲除小鼠 Bco2-/-小鼠

重点核对

ApoA-I-/-/Bco2-/-和Bco2-/-小鼠基因型确认(PCR) 血清中ApoA-I蛋白表达验证(western blot) 混合类胡萝卜素饲料中三种类胡萝卜素比例1:1:1 喂养周期:4周维生素A缺乏饮食后4周类胡萝卜素饮食 ApoA-I与类胡萝卜素的结合亲和力(SPR)

摘要

补充抗氧化类胡萝卜素是预防年龄相关性黄斑变性(AMD)的治疗策略;然而,类胡萝卜素从肝脏到视网膜的转运机制仍未完全明了。在此,我们研究HDL是否作为黄斑类胡萝卜素的主要转运体。我们从BCO2敲除(Bco2−/−)小鼠(一种能够在视网膜中积累类胡萝卜素的黄斑色素小鼠模型)中基因敲除了HDL的关键载脂蛋白ApoA-I。随后,我们进行了为期一个月的混合类胡萝卜素饲料(叶黄素:玉米黄质:β-胡萝卜素=1:1:1)喂养实验。HPLC数据显示,与Bco2−/−小鼠相比,ApoA-I−/−/Bco2−/−小鼠肝脏中的总类胡萝卜素增加,而血清、视网膜色素上皮(RPE)/脉络膜和视网膜中的总类胡萝卜素减少。具体来说,ApoA-I缺失导致肝脏中β-胡萝卜素显著增加,但叶黄素和玉米黄质未显著增加;血清中所有三种类胡萝卜素均减少;阻断了大部分玉米黄质和β-胡萝卜素向RPE/脉络膜的转运;并显著降低了视网膜中的β-胡萝卜素和玉米黄质,但叶黄素未显著降低。此外,表面等离子体共振光谱(SPR)数据显示,ApoA-I与β-胡萝卜素>>玉米黄质>叶黄素的结合亲和力依次降低。我们的结果表明,类胡萝卜素主要通过HDL从肝脏转运到眼睛,ApoA-I可能参与黄斑类胡萝卜素向RPE的选择性递送。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
HDL是否作为类胡萝卜素从肝脏转运至视网膜的主要转运体?ApoA-I是否参与黄斑类胡萝卜素的选择性递送?
核心机制
类胡萝卜素主要通过HDL从肝脏转运至眼睛,ApoA-I对β-胡萝卜素和玉米黄质的结合亲和力高于叶黄素,可能介导选择性递送。
主要证据
在ApoA-I-/-/Bco2-/-小鼠中,肝脏总类胡萝卜素增加,血清、RPE/脉络膜和视网膜中的类胡萝卜素减少;SPR显示ApoA-I与β-胡萝卜素、玉米黄质、叶黄素的KD值分别为0.33 μM、5.6 μM、12.14 μM。
研究意义
这些数据可能增强对黄斑类胡萝卜素转运的理解,并为通过类胡萝卜素预防AMD提供新的见解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

小鼠模型构建与验证

建立ApoA-I-/-/Bco2-/-双敲除小鼠,并确认基因敲除和蛋白表达缺失。

通过ApoA-I-/-小鼠与Bco2-/-小鼠杂交获得双敲除小鼠;通过PCR基因分型确认基因型;通过western blot检测血清中ApoA-I蛋白表达。

2

类胡萝卜素喂养实验

研究ApoA-I缺失对体内类胡萝卜素分布的影响。

将小鼠分为两组,先喂食维生素A缺乏饮食(AIN-93)4周,再喂食含混合类胡萝卜素(叶黄素:玉米黄质:β-胡萝卜素=1:1:1)的饲料4周,然后收集肝脏、血清、RPE/脉络膜和视网膜进行HPLC分析。

3

类胡萝卜素提取和HPLC分析

定量检测不同组织中叶黄素、玉米黄质和β-胡萝卜素的含量。

从肝脏、血清、RPE/脉络膜和视网膜中提取类胡萝卜素,使用HPLC系统(硅胶基腈基键合柱)进行分析。

4

SPR结合亲和力测定

测定ApoA-I与不同类胡萝卜素的结合亲和力。

使用SPR光谱仪(SensiQ Pioneer),通过胺偶联固定ApoA-I,注入不同浓度的类胡萝卜素溶液,测定平衡解离常数KD。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
ECL Plus蛋白质印迹检测试剂GE HealthCare--
四氢呋喃Sigma Chemicals--
丁基羟基甲苯Sigma Chemicals--
乙酸乙酯Thermo Fisher--
硅胶基腈基键合柱Regis Chemical--
SensiQ Pioneer光学生物传感器Pall ForteBio--
羧基修饰传感器芯片Pall ForteBio--
AIN-93维生素A缺乏饲料----
类胡萝卜素饲料TestDiet--
ApoA-I抗体Abnova# H335-D01P
肌动蛋白抗体Sigma-Aldrich#A2066
山羊抗兔IgG(HRP标记)Alpha Diagnostic International# 20320
重组人ApoA-I蛋白Sino Biological#10686-H07E
IRBP蛋白----
重组人StARD3蛋白----
玉米黄质标准品DSM Nutritional Products, Ltd.--
中玉米黄质DSM Nutritional Products, Ltd.--
叶黄素Kemin Health--
β-胡萝卜素Sigma Chemicals--
虾青素Sigma Chemicals--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
小鼠模型构建
ApoA-I-/-小鼠和Bco2-/-小鼠的来源;基因分型引物和PCR条件;Western blot中血清用量和抗体稀释度
阅读提示:Methods 2和3,以及Figure 1说明
类胡萝卜素喂养实验
小鼠周龄和数量;饮食方案(维生素A缺乏饮食和类胡萝卜素饮食的持续时间);类胡萝卜素混合比例和每日摄入量
阅读提示:Methods 4和Figure 2 legend
HPLC分析
组织样本的采集和汇集方式;提取溶剂和步骤;HPLC柱类型、流动相、流速、检测波长和柱温
阅读提示:Methods 5和Figures 3-6 legends
SPR结合实验
固定方法(胺偶联);类胡萝卜素浓度范围;KD值读取方式和统计分析
阅读提示:Methods 6和Table 1
统计分析
使用的统计检验(ANOVA和t-test)和软件;显著性水平(P<0.05)
阅读提示:Methods 7