体外筛选合成纳米抗体
从高多样性文库中筛选靶向SARS-CoV-2 RBD的合成纳米抗体。
使用RBD作为诱饵，通过一轮核糖体展示和三轮噬菌体展示从Concave、Loop和Convex三个文库中筛选sybodies，并通过ELISA鉴定阳性克隆。
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一种靶向RBD的合成纳米抗体保护仓鼠免受SARS-CoV-2感染
A synthetic nanobody targeting RBD protects hamsters from SARS-CoV-2 infection.
实验完整度
高研究包含体外筛选、生物化学与结构表征（X射线晶体学、冷冻电镜、HDX-MS）、细胞水平中和实验、小鼠和仓鼠体内攻毒实验等多个独立证据层级，并明确进行了功能验证与机制验证。
主要模型
VeroE6-hACE2细胞 C57BL/6J小鼠（hACE2腺病毒致敏） 叙利亚金仓鼠（RjHan:AURA）
重点核对
sybody浓度与IC50测定（假病毒中和实验，VeroE6-hACE2细胞） MR3-MR3-ABD在仓鼠中的给药剂量（2.5 mg/只）和给药时间（感染前6小时） Fc-MR3在仓鼠中的给药剂量（2.5 mg/只）和给药时间（感染前6小时） 仓鼠攻毒病毒株（BetaCoV/Munich/BavPat1/2020）和剂量（105 TCID50）
摘要
SARS-CoV-2是COVID-19的病原体，其受体结合域（RBD）负责与宿主细胞ACE2蛋白结合。阻断RBD-ACE2相互作用的中和抗体是开发靶向治疗药物的候选方案。羊驼来源的单域抗体（纳米抗体，约15 kDa）因其体积小、稳定性高，在生物利用度、可操作性和生产储存方面具有优势。在此，我们报告了通过体外筛选三个文库，快速筛选出99种针对RBD的合成纳米抗体（sybodies）。最佳sybody MR3以高亲和力（KD = 1.0 nM）结合RBD，并对SARS-CoV-2假病毒表现出高中和活性（IC50 = 0.42 μg mL−1）。结构、生化和生物学表征表明了一种共同的中和机制，即sybodies竞争性抑制RBD-ACE2相互作用。通过基于结构的设计、双互补位构建和二价工程，生成了多种效力提高的sybody形式。MR3的两种二价形式在活病毒攻击后可保护仓鼠免受临床症状，单次给予MR3的Fc融合构建体可将病毒RNA载量降低6个Log10。我们的结果为开发针对COVID-19的治疗性纳米抗体铺平了道路，并提出了一种在疫情暴发期间快速开发靶向医疗干预措施的策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 合成纳米抗体（sybodies）能否通过靶向SARS-CoV-2 RBD来中和病毒并提供体内保护？
- 核心机制
- sybodies通过竞争性阻断RBD与ACE2的相互作用来中和SARS-CoV-2。结构分析显示SR4和MR17结合RBD的受体结合基序（RBM），与ACE2结合位点重叠；MR3的表位也位于RBM区域。
- 主要证据
- 体外筛选获得99种sybodies，其中MR3具有最高亲和力（KD=1.0 nM）和中和活性（IC50=0.42 μg/mL）；X射线晶体学解析了SR4-RBD和MR17-RBD复合物结构；BLI竞争实验证实sybodies与ACE2竞争RBD结合；假病毒中和实验验证了中和活性；仓鼠攻毒实验中，MR3-MR3-ABD和Fc-MR3减轻了体重下降，Fc-MR3将肺病毒RNA载量降低6 Log10并完全保护肺部病理损伤。
- 研究意义
- 该研究为开发针对COVID-19的治疗性纳米抗体铺平了道路，并提出了一种在疫情暴发期间快速开发靶向医疗干预措施的策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
中和活性初步筛选
筛选具有中和SARS-CoV-2假病毒活性的sybodies。
使用携带SARS-CoV-2 S蛋白的逆转录病毒假病毒颗粒感染VeroE6-hACE2细胞，通过FACS检测GFP表达来测定中和活性。
结构与结合特性表征
解析sybodies与RBD结合的结构基础，并测定结合动力学。
通过X射线晶体学解析SR4-RBD和MR17-RBD复合物结构；通过BLI测定结合动力学；通过HDX-MS和突变分析确定MR3的表位。
工程化改造提高效力
通过多价工程（双互补位、Fc融合、串联融合）提高sybodies的中和活性。
构建双互补位LR5-MR3、Fc融合Fc-MR3和Fc-MR17、串联融合MR3-MR3等，并测定中和活性。
体内药效评估
评估二价MR3在动物模型中的保护效果。
在小鼠模型中初步评估MR3-MR3-ABD的保护效果，随后在仓鼠模型中评估MR3-MR3-ABD和Fc-MR3对SARS-CoV-2感染的保护作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质表达与纯化 | Ni-Sepharose Excel | GE Healthcare | 17-3712-03 |
| Superdex Increase 200 10/300 GL | -- | -- | |
| Bio-Rad Econo-Pac 10DG 柱 | Bio-Rad | 732-2010 | |
| Ni-NTA 磁珠 | -- | -- | |
| 重组蛋白A磁珠 | SmartLifesciences | SA012005 | |
| pPICZαC 载体 | Invitrogen | -- | |
| PUREfrex 2.1试剂盒 | Genefrontier | PF213-0.25-EX | |
| Dynabeads Myone 链霉亲和素 T1 | -- | -- | |
| 逆转录酶（Agilent） | Agilent | 200436 | |
| DNA纯化试剂盒（Macherey-Nagel） | Macherey-Nagel | A740609.25 | |
| ELISA | Maxi-Sorp 96孔板 | Thermo Fisher | 442404 |
| 抗Myc抗体 | Sigma | M4439 | |
| 链霉亲和素偶联辣根过氧化物酶 | Sigma | S2438 | |
| FSEC | 链霉亲和素（AAT Bioquest） | AAT Bioquest | 16955 |
| 分析型凝胶过滤柱 | Sepax | 9F16206 | |
| 带荧光检测器的HPLC系统（Shimadzu） | Shimadzu | RF-20A | |
| BLI | Octet RED96系统 | ForteBio | -- |
| SA传感器 | -- | 18-5019 | |
| 胺反应性交联剂 | Thermo Fisher | 21338 | |
| ACE2（Sino Biological） | Sino Biological | 10108-H08B | |
| 中和实验 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 聚乙烯亚胺 | -- | -- | |
| 病毒检测 | Opti-MEM I (1x) + GlutaMAX | -- | -- |
| 组织病理学 | 抗核蛋白（SARS-CoV-2）多克隆抗体 | Sino Biological | 40143-T62 |
| 山羊抗兔IgG HRP | DAKO | P0448 | |
| 分子生物学 | 吉布森组装 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 中和实验 | VeroE6-hACE2细胞数量（104细胞/孔）、病毒与sybody预孵育时间（1小时）、共孵育时间（6小时）、检测时间（72小时） 阅读提示：Methods: Pseudotyped particle production and neutralizing assays |
| 仓鼠攻毒实验 | 仓鼠品系、性别、年龄、给药剂量（2.5 mg/只）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（攻毒前6小时）、攻毒病毒株（BetaCoV/Munich/BavPat1/2020）、攻毒剂量（105 TCID50）、攻毒途径（鼻内）、检测时间（4 dpi） 阅读提示：Methods: Animal procedures SARS-CoV-2 (hamsters) |
| 小鼠攻毒实验 | 小鼠品系、性别、年龄、hACE2腺病毒致敏时间（5天）、攻毒病毒株（hCoV-19/China/CAS-B001/2020）、攻毒剂量（5×105 TCID50）、给药剂量（25 mg/kg）、给药途径（腹腔注射）、给药时间（攻毒后12小时） 阅读提示：Methods: Mice challenge experiments |
| BLI结合实验 | RBD浓度（2 μg/mL）、sybody浓度范围、结合和解离时间（120或300秒结合，600秒解离） 阅读提示：Methods: BLI assay |