鉴定异戊二烯在Treg细胞活化中的作用
验证甲羟戊酸衍生的异戊二烯是否对Treg细胞活化及抑制功能至关重要。
使用GSEA分析公开的Treg细胞活化数据集，检测甲羟戊酸通路基因表达；用辛伐他汀抑制HMGCR，补充甲羟戊酸、FPP或GGPP，检测Treg细胞活化、增殖及抑制功能。
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蛋白质异戊二烯化驱动效应调节性T细胞分化和维持的离散信号程序
Protein Prenylation Drives Discrete Signaling Programs for the Differentiation and Maintenance of Effector Treg Cells
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内基因敲除小鼠模型、混合骨髓嵌合体、转录组和ATAC-seq等多层级验证，并通过回补实验验证机制。
主要模型
小鼠调节性T细胞（Treg细胞） Foxp3CreFntbfl/fl和Foxp3CrePggt1bfl/fl小鼠 混合骨髓嵌合体小鼠 逆转录病毒介导的骨髓移植小鼠（retrogenic mice）
重点核对
Treg细胞特异性敲除Fntb或Pggt1b的小鼠模型 他汀类药物（辛伐他汀）处理及FPP或GGPP回补实验 体外Treg细胞抑制功能实验 基因表达谱和ATAC-seq分析 ICOS过表达回补实验
摘要
效应调节性T（eTreg）细胞对免疫耐受至关重要，其生成依赖于T细胞受体（TCR）信号。促进eTreg细胞分化和维持的免疫代谢信号机制仍不清楚。在这里，我们表明异戊二烯依赖的翻译后脂质修饰通过影响TCR诱导的细胞内信号来决定eTreg细胞的积累和功能。我们发现异戊二烯对于活化Treg细胞的抑制活性至关重要，并且Treg细胞特异性删除法尼基化促进酶Fntb或香叶基香叶基化促进酶Pggt1b会导致致命的自身免疫疾病，与eTreg细胞积累减少相关。机制上，Fntb通过调节mTORC1活性和ICOS表达来促进eTreg细胞维持。相比之下，Pggt1b作为TCR依赖性转录编程和Rac介导信号传导的调节器，以建立eTreg细胞分化和免疫耐受。因此，我们的结果确定了免疫受体信号传导与代谢介导的翻译后脂质修饰之间的双向代谢信号，用于eTreg细胞的分化和维持。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 代谢驱动的蛋白质异戊二烯化（法尼基化和香叶基香叶基化）是否以及如何调控效应调节性T细胞的分化和维持？
- 核心机制
- Fntb通过维持mTORC1活性和ICOS表达来促进eTreg细胞维持；Pggt1b通过调节TCR信号强度和Rac信号传导来驱动eTreg细胞分化。
- 主要证据
- 基因敲除小鼠模型、体外抑制实验、转录组分析和ATAC-seq揭示的染色质可及性变化，以及ICOS过表达和Rac1 G12V回补实验。
- 研究意义
- 建立了免疫受体信号与代谢介导的翻译后脂质修饰之间的双向信号调控，为自身免疫病、癌症和感染性疾病中调节Treg细胞活性提供了潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建Treg细胞特异性基因敲除小鼠
研究Fntb和Pggt1b在Treg细胞中的生理功能。
将Fntbfl/fl或Pggt1bfl/fl小鼠与Foxp3Cre小鼠杂交，获得Treg细胞特异性敲除小鼠，分析其自身免疫病表型、免疫细胞活化和Treg细胞抑制功能。
评估Fntb和Pggt1b对eTreg细胞积累的影响
确定Fntb和Pggt1b是否以细胞内在方式影响eTreg细胞积累。
通过混合骨髓嵌合体、转录组分析、eTreg细胞频率和数量检测、Ki67增殖染色，以及非淋巴组织中Treg细胞数量分析。
解析Fntb和Pggt1b对eTreg细胞分化与维持的差异作用
区分Fntb和Pggt1b在eTreg细胞分化和维持中的不同功能。
分选cTreg细胞进行体外活化，比较eTreg样细胞生成；使用FTI和GGTI抑制剂处理进行WGCNA转录组分析，揭示受调控的基因模块。
阐明Fntb调控eTreg细胞维持的机制
验证Fntb是否通过mTORC1和ICOS信号维持eTreg细胞。
检测FTI处理或Fntb缺陷cTreg细胞中mTORC1下游p-S6和p-4EBP1水平；通过Tsc1共缺失和ICOS过表达回补实验验证其对eTreg细胞维持的作用；进行ATAC-seq分析染色质可及性。
阐明Pggt1b调控eTreg细胞分化的机制
验证Pggt1b是否通过调节TCR信号和Rac信号驱动eTreg细胞分化。
进行ATAC-seq分析转录因子基序，检测TCR信号强度（CD5和Nur77-GFP）以及Treg细胞与DC的粘附；通过Rac1 G12V过表达回补实验验证Rac信号的作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
体内模型建立
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与处理 | 辛伐他汀 | Selleck Chemicals | S1792 |
| 法尼基焦磷酸 | Sigma-Aldrich | 13058-04-3 | |
| 香叶基香叶基焦磷酸 | Sigma-Aldrich | G6025 | |
| 法尼基转移酶抑制剂-277 | Tocris | 2407 | |
| 香叶基香叶基转移酶抑制剂-2147 | Sigma-Aldrich | 191102-87-1 | |
| DGBP | -- | -- | |
| 甲羟戊酸内酯 | Sigma-Aldrich | M4667-5G | |
| 重组人IL-2 | R&D Systems | 202-IL | |
| 重组人IL-6 | National Cancer Institute | NSC720836 | |
| 重组鼠IL-3 | Thermo Fisher Scientific | PMC0034 | |
| 重组鼠干细胞因子 | Thermo Fisher Scientific | PMC2115 | |
| 流式细胞术 | CellTrace紫 | Thermo Fisher Scientific | C34557 |
| 可固定活力染料eFluor 780 | Thermo Fisher Scientific | 65-0865-18 | |
| Foxp3转录因子染色缓冲液套装 | Thermo Fisher Scientific | 00-5523-00 | |
| Cytofix/Cytoperm固定/透化溶液试剂盒 | BD Biosciences | 554714 | |
| BD Phosflow固定缓冲液I | BD Biosciences | 557870 | |
| Phosflow透化缓冲液III | BD Biosciences | 558050 | |
| 细胞培养 | 谱系细胞去除试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-090-858 |
| CD11c微珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| Click's培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| β-巯基乙醇 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 抗CD3抗体 | Bio X Cell | BE0001 | |
| 抗CD28抗体 | Bio X Cell | BE0015-1 | |
| 细胞刺激 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | P8139 |
| 离子霉素 | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| 高尔基体阻断剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| 蛋白检测 | 抗磷酸化S6抗体 | Cell Signaling Technology | 4858 |
| 抗磷酸化4EBP1抗体 | Cell Signaling Technology | 2855 | |
| 抗Rap1A抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1482 | |
| 抗HDJ2抗体 | Lab Vision | MS-225-P0 | |
| 抗β-肌动蛋白抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47778 HRP | |
| 抗β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | 2146 | |
| 流式细胞术 | 抗CD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-80 |
| 抗CD4抗体 | BioLegend | 116006 | |
| 抗CD8α抗体 | BioLegend | 100742 | |
| 抗TCRβ抗体 | Thermo Fisher Scientific | 47-5961-82 | |
| 抗CD44抗体 | BioLegend | 103047 | |
| 抗CD62L抗体 | Tonbo Biosciences | 60-0621 | |
| 抗CD69抗体 | Thermo Fisher Scientific | 48-0691-82 | |
| 抗CD45.1抗体 | BioLegend | 110736 | |
| 抗CD45.2抗体 | Thermo Fisher Scientific | 48-0454-80 | |
| 抗CD25抗体 | Thermo Fisher Scientific | 17-0251-82 | |
| 抗Foxp3抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-5773-80 | |
| 抗Ki67抗体 | Thermo Fisher Scientific | 25-5698-80 | |
| 抗IFN-γ抗体 | Thermo Fisher Scientific | 17-7311-81 | |
| 抗IL-4抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-7041-71 | |
| 抗IL-17抗体 | Thermo Fisher Scientific | 45-7177-80 | |
| 抗Mcl1抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-9047-42 | |
| 抗Bcl2抗体 | BioLegend | 633510 | |
| 抗ICOS抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-9942-82 | |
| 抗CTLA4抗体 | BioLegend | 106312 | |
| 抗CD5抗体 | Thermo Fisher Scientific | 12-0051-81 | |
| 抗Bim抗体 | Cell Signaling Technology | 2933 | |
| 组织病理 | 抗CD4抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-9766 |
| 抗CD8抗体 | Thermo Fisher Scientific | 14-0808-82 | |
| 抗Iba1抗体 | Biocare Medical | CP290A | |
| 抗精氨酸酶1抗体 | Biocare Medical | sc-20150 | |
| 抗Mcpt1抗体 | eBioscience | 14-55303-82 | |
| ATAC-seq | 转座酶 | Illumina | -- |
| Qiagen MinElute试剂盒 | Qiagen | -- | |
| NEBNext HiFi试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| KAPA SYBRFast | Kapa Biosystems | -- | |
| 基因表达谱 | GeneChip小鼠基因2.0 ST芯片 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Clariom S小鼠芯片 | Thermo Fisher Scientific | 902930 | |
| 流式细胞术仪器 | LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| MoFlow细胞分选仪 | Beckman-Coulter | -- | |
| Reflection细胞分选仪 | iCyt | -- | |
| 共聚焦显微镜 | ODYSSEY Fc分析仪 | LI-COR | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系：Fntbfl/fl、Pggt1bfl/fl、Foxp3Cre、Cd4Cre、Tsc1fl/fl、Rac1fl/fl、Rac2-/- 阅读提示：STAR Methods: Mice |
| 混合骨髓嵌合体 | 骨髓细胞比例（1:1），照射剂量（5 Gy），受体小鼠（Rag1-/-），分析时间（7-8周） 阅读提示：STAR Methods: Mixed bone marrow chimera generation |
| 细胞培养与处理 | 细胞纯度、刺激抗体浓度（10 μg/ml anti-CD3/28）、IL-2浓度（200 U/ml）、抑制剂浓度（FTI-277 10 μM, GGTI-2147 5 μM）、处理时间（1小时预处理，持续处理） 阅读提示：STAR Methods: Cell purification and culture |
| 抑制实验 | Treg细胞活化时间（3天）、效应细胞（naïve CD4+ T cells）、共培养比例 阅读提示：STAR Methods: Cell purification and culture (Treg-cell suppressive assays) |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、荧光素标记、固定/破膜方案（Foxp3缓冲液或Phosflow）、细胞活力染料（FVD） 阅读提示：STAR Methods: Flow cytometry |
| ATAC-seq | 细胞数量、转座酶反应条件（37°C 30分钟）、PCR循环数、数据分析参数 阅读提示：STAR Methods: ATAC-Seq library preparation and ATAC-Seq analysis |
| 转录组分析 | RNA提取方法、芯片类型（Clariom S mouse array）、差异表达阈值（|log2FC|>0.5, FDR<0.05） 阅读提示：STAR Methods: Gene-expression profiling and bioinformatic analysis |