基因敲除细胞系的构建与验证
获得MIC26、MIC27单敲除和双敲除细胞系，以研究其功能。
使用CRISPR-Cas方法在HAP1细胞中生成MIC26单敲除、MIC27单敲除和双敲除细胞系，并通过Western blot和qRT-PCR验证蛋白和mRNA水平的变化。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
MIC26和MIC27协同调节心磷脂水平及OXPHOS复合物的组成
MIC26 and MIC27 cooperate to regulate cardiolipin levels and the landscape of OXPHOS complexes.
实验完整度
高包含细胞系基因敲除、电子显微镜、STED、复合物谱分析、BN-PAGE、呼吸测量、脂质分析等多个独立实验层级，并有功能验证。
主要模型
HAP1细胞系（野生型、MIC26单敲除、MIC27单敲除、双敲除） 稳定过表达MIC26/MIC27或CRLS1的HAP1细胞系
重点核对
MIC26和MIC27单敲除及双敲除的HAP1细胞模型 心磷脂水平变化及CRLS1过表达对呼吸链复合物稳定性的影响 F1Fo-ATP合酶复合物的稳定性及F1亚基的整合 线粒体嵴超微结构及CJs数量的定量分析
摘要
MICOS复合物的载脂蛋白MIC26和MIC27协同管理嵴结构、心磷脂水平以及呼吸链超复合物和F1Fo-ATP合酶的总体稳定性与完整性。
同源的MICOS复合物载脂蛋白MIC26和MIC27，其蛋白水平表现出拮抗性调控，这使得难以通过单个基因缺失来推断它们各自的功能。我们获得了MIC26和MIC27的单敲除和双敲除（DKO）人类细胞，发现DKO细胞表现出更多同心圆状嵴且失去嵴连接（CJs），比任何单敲除都更明显，表明它们在CJs形成中具有重叠作用。结合复合物谱分析、STED纳米显微镜和蓝色凝胶电泳，我们发现MIC26和MIC27对于其余MICOS亚基的稳定性和整合入复合物并非必需，表明它们在MICOS复合物中组装较晚。MIC26和MIC27协同作用于呼吸链（超）复合物（RCs/SC）及F1Fo-ATP合酶复合物的完整性，以及F1亚基整合到单体F1Fo-ATP合酶中。虽然DKO细胞中心磷脂减少，但在DKO中过表达心磷脂合酶可恢复RCs/SC的稳定性。总体而言，我们提出MIC26和MIC27通过调节心磷脂水平协同维持多聚OXPHOS复合物的整体完整性和稳定性。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- MIC26和MIC27在调控线粒体嵴结构和OXPHOS复合物稳定性中的具体作用及其协同机制是什么？
- 核心机制
- MIC26和MIC27通过调节心磷脂水平，协同维持呼吸链复合物和超复合物及F1Fo-ATP合酶的稳定性和完整性，进而影响嵴结构。
- 主要证据
- 使用HAP1单敲除和双敲除细胞，结合电子显微镜、STED、复合物谱分析、BN-PAGE和呼吸测量等，发现DKO细胞表现出嵴异常、CJs减少、心磷脂水平降低和OXPHOS复合物稳定性下降，而CRLS1过表达可恢复RCs/SC稳定性。
- 研究意义
- 揭示了MIC26和MIC27在维持线粒体功能中的新协同作用，为理解相关人类疾病（如糖尿病心肌病和线粒体肌病）的病理机制提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
线粒体嵴超微结构分析
评估MIC26和MIC27缺失对嵴形态和CJs形成的影响。
使用电子显微镜观察野生型、单敲除和双敲除细胞的线粒体嵴结构，并定量分析异常嵴比例、嵴数量及CJs数量。
线粒体呼吸功能检测
评估MIC26和MIC27缺失对细胞呼吸的影响。
使用Seahorse XFe96分析仪测量基础呼吸、最大呼吸和ATP产生等参数，并验证双敲除细胞中过表达MIC26和MIC27或CRLS1能否恢复呼吸功能。
MICOS复合物完整性分析
检测MIC26和MIC27缺失是否影响MICOS复合物的组装和稳定性。
通过Western blot检测MICOS各亚基的稳态水平，使用STED纳米显微镜观察MIC60和MIC10的定位，并通过复合物谱分析和BN-PAGE分析MICOS复合物的分子量分布。
F1Fo-ATP合酶组装和稳定性分析
研究MIC26和MIC27缺失对F1Fo-ATP合酶组装和稳定性的影响。
通过原位凝胶活性测定、BN-PAGE和复合物谱分析检测F1Fo-ATP合酶的寡聚状态、单体水平及F1亚基的整合情况。
呼吸链复合物和超复合物稳定性分析
确定MIC26和MIC27缺失对呼吸链复合物及超复合物形成的影响。
通过BN-PAGE和复合物谱分析检测复合物I、III、IV及其超复合物的水平，并评估OPA1表达变化是否参与其中。
心磷脂水平分析及功能恢复实验
验证MIC26和MIC27缺失是否影响心磷脂水平，并测试心磷脂合酶过表达能否恢复呼吸链复合物稳定性。
使用质谱分析测定心磷脂水平，并在DKO细胞中稳定过表达CRLS1，通过BN-PAGE检测呼吸链复合物和超复合物的恢复情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素和链霉素 | -- | -- | |
| 基因敲除 | CRISPR-Cas | -- | -- |
| 稳定细胞系构建 | pMSCVpuro载体 | Clontech | PT3303-5 |
| GIBSON克隆 | New England Biolabs | E2611L | |
| FuGENE转染试剂 | Promega | -- | |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 电子显微镜 | 醋酸铀酰 | -- | -- |
| 磷钨酸 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| Lowry法 | Bio-Rad | -- | |
| MIC13抗体 | Pineda | custom-made | |
| MIC27抗体 | Atlas Antibodies | HPA000612 | |
| MIC26抗体 | Thermo Fisher Scientific | MA5-15493 | |
| MIC60抗体 | Pineda | custom-made | |
| MIC10抗体 | Abcam | ab84969 | |
| MIC25抗体 | Proteintech | 20639-1-AP | |
| β-微管蛋白抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| MIC19抗体 | Proteintech | 25625-1-AP | |
| ATP5A抗体 | Abcam | ab14748 | |
| ATP5G抗体 | Abcam | -- | |
| ATP5D抗体 | Abcam | ab97491 | |
| ATP5IF1抗体 | Abcam | ab110277 | |
| ATP5I抗体 | Proteintech | 16483-1-AP | |
| NDUFB4抗体 | Abcam | ab110243 | |
| SDHB抗体 | Abcam | ab14714 | |
| UQCRC2抗体 | Abcam | ab14745 | |
| COXIV抗体 | Abcam | ab16056 | |
| OPA1抗体 | Pineda | custom-made | |
| VILBER LOURMAT Fusion SL成像系统 | Peqlab | -- | |
| 呼吸测量 | 海马XFe96分析仪 | Agilent | -- |
| 海马XF96细胞培养板 | Agilent | -- | |
| DMEM培养基 | Sigma-Aldrich | D5030 | |
| 海马XF细胞线粒体压力测试试剂盒 | Agilent | -- | |
| 寡霉素 | -- | -- | |
| FCCP | -- | -- | |
| 鱼藤酮 | -- | -- | |
| 抗霉素 | -- | -- | |
| 线粒体形态 | PerkinElmer转盘共聚焦显微镜 | PerkinElmer | -- |
| Hamamatsu C9100相机 | Hamamatsu | -- | |
| 免疫荧光 | Triton X-100 | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| STED | Leica SP8显微镜 | Leica | -- |
| Abberior STAR 635P染料 | Abberior | -- | |
| 小鼠抗GFP抗体 | Merck | 11814460001 | |
| Alexa Fluor 488染料 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 复合物谱分析 | ProteomeXchange数据库 | -- | PXD016733, PXD016732 |
| 线粒体分离 | 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| 洋地黄皂苷 | -- | -- | |
| 原位凝胶活性 | ATP | -- | -- |
| qRT-PCR | QIAshredder柱 | QIAGEN | -- |
| RNeasy试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| QuantiNova逆转录试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| QuantiNova SYBR Green PCR试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Rotorgene 6000 | Corbett Research/QIAGEN | -- | |
| 脂质分析 | 混合研磨仪 | Retsch | -- |
| 丁基羟基甲苯 | -- | -- | |
| 18:3/18:3/18:3三酰甘油 | Larodan | -- | |
| Pierce BCA试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 1290 Infinity II液相色谱系统 | Agilent | -- | |
| Zorbax Extend-C18色谱柱 | Agilent | -- | |
| 6560离子淌度Q-TOF质谱仪 | Agilent | -- | |
| 统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 基因敲除细胞系构建 | CRISPR-Cas靶向序列、敲除类型（1bp插入、8bp缺失、160bp缺失）、细胞系来源（HAP1） 阅读提示：Materials and Methods, Cell culture |
| 线粒体嵴超微结构分析 | 细胞固定条件（3%戊二醛）、染色条件（1%四氧化锇、1%醋酸铀酰/磷钨酸）、电子显微镜型号（Hitachi H600）、统计样本量（60-90个线粒体切面） 阅读提示：Materials and Methods, Electron microscopy; Figure 1C-G |
| 呼吸功能检测 | 细胞接种密度（3×10^4至3.3×10^4细胞/孔）、培养基（DMEM D5030）、底物（葡萄糖、谷氨酰胺、丙酮酸）、药物浓度（Oligomycin、FCCP、Rotenone/Antimycin）、归一化方法（Hoechst染色） 阅读提示：Materials and Methods, Respiration measurements; Figure 2A |
| MICOS复合物分析 | 抗体信息（MIC13、MIC27、MIC26、MIC60、MIC10等）、STED成像参数（激发/耗尽激光波长、门控时间）、BN-PAGE条件（digitonin浓度、梯度胶） 阅读提示：Materials and Methods, STED super-resolution nanoscopy, Mitochondrial isolation and BN gel electrophoresis; Figures 3 and 4 |
| F1Fo-ATP合酶分析 | digitonin浓度梯度、原位凝胶活性检测条件（ATP浓度、孵育时间）、BN-PAGE及抗体（ATP5D） 阅读提示：Materials and Methods, In-gel activity of F1Fo–ATP synthase, Mitochondrial isolation and BN gel electrophoresis; Figure 5 |
| 呼吸链复合物分析 | BN-PAGE条件、抗体（NDUFB4、UQCRC2、COXIV）、复合物谱分析数据 阅读提示：Materials and Methods, Mitochondrial isolation and BN gel electrophoresis; Figure 6 |
| 心磷脂分析 | 脂质提取方法（Matyash法）、质谱参数、内标（18:3/18:3/18:3 TAG）、归一化方法（蛋白量） 阅读提示：Materials and Methods, Lipid analysis; Figure 7A-B |