鉴定AKAP8L与mTORC1的相互作用
发现并验证AKAP8L是mTORC1的新相互作用蛋白
在HEK293A细胞中过表达FLAG标签的Raptor，通过抗FLAG免疫沉淀和质谱鉴定候选相互作用蛋白，随后通过免疫共沉淀验证内源和过表达情况下的相互作用。
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A激酶锚定蛋白8L与mTORC1相互作用并促进细胞生长
A-kinase anchoring protein 8L interacts with mTORC1 and promotes cell growth.
实验完整度
高通过免疫共沉淀、细胞定位、CRISPR-Cas9敲除、救援实验、多聚核糖体分析及细胞功能检测等多层级实验验证。
主要模型
HEK293A细胞 AKAP8L敲除HEK293A细胞 小鼠胚胎成纤维细胞
重点核对
AKAP8L与mTORC1的相互作用依赖于其N端63-247氨基酸区域 AKAP8L与mTORC1的相互作用发生在细胞质中 AKAP8L通过PKA调节亚基Iα锚定PKA AKAP8L敲除导致蛋白质合成、细胞大小和增殖减少，全长AKAP8L可恢复，而缺失N端区域的突变体不能
摘要
mTOR复合物1（mTORC1）感知营养物质以介导细胞内的合成代谢过程。mTORC1究竟如何促进细胞生长仍不清楚。在此，我们鉴定了一种新的mTORC1相互作用蛋白，称为蛋白激酶A锚定蛋白8L（AKAP8L）。通过生化实验，我们发现AKAP8L的N端区域在细胞质中与mTORC1结合。重要的是，AKAP8L的缺失减少了mTORC1介导的过程，如翻译、细胞生长和细胞增殖。AKAP通过PKA调节亚基锚定蛋白激酶A（PKA），我们证明AKAP8L可以通过调节亚基Iα锚定PKA。将全长AKAP8L重新导入细胞可恢复mTORC1调节的过程，而重新导入缺少与mTORC1相互作用的N端区域的AKAP8L则不能。我们的结果表明AKAP在细胞中具有多方面作用。我们得出结论，mTORC1似乎通过AKAP8L部分地调节细胞生长。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- mTORC1如何促进细胞生长，以及是否有新的相互作用蛋白参与该过程？
- 核心机制
- AKAP8L通过其N端区域在细胞质中与mTORC1结合，促进mTORC1介导的蛋白质翻译、细胞生长和增殖，但具体分子机制尚不清楚。
- 主要证据
- 通过质谱鉴定、免疫共沉淀、CRISPR-Cas9敲除、救援实验、多聚核糖体分析及细胞大小和增殖检测，证明AKAP8L与mTORC1相互作用并促进其功能。
- 研究意义
- 揭示了AKAP家族成员在mTORC1信号通路中的新作用，为理解细胞生长调控提供了新视角，并可能为治疗mTORC1相关疾病提供新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定AKAP8L与mTORC1相互作用的结构域
定位AKAP8L中与mTORC1结合的关键区域
构建一系列AKAP8L截短体，与HA标签Raptor共表达，通过免疫共沉淀检测相互作用，确定N端63-247氨基酸区域是必要的和充分的。
验证AKAP8L与mTORC1相互作用的亚细胞定位
确定AKAP8L与mTORC1在细胞内的相互作用位置
通过免疫荧光和亚细胞分级分离确认AKAP8L在细胞质和细胞核均有定位，并通过分级分离后免疫共沉淀确定与Raptor的相互作用发生在细胞质。
研究AKAP8L与PKA复合物的关联
探究AKAP8L是否与PKA调节亚基和催化亚基形成复合物
通过免疫共沉淀检测AKAP8L与PKA调节亚基Iα、IIα以及催化亚基的相互作用，发现AKAP8L与RIα和催化亚基结合，但不与RIIα结合。
评估AKAP8L对mTORC1底物磷酸化的影响
检测AKAP8L是否影响mTORC1对已知底物的磷酸化
过表达或敲低AKAP8L，检测Raptor Ser-791磷酸化以及S6K、4EBP1、LARP1、ULK1等底物的磷酸化水平，未发现明显变化。
分析AKAP8L对mTORC1介导的生物学功能的影响
验证AKAP8L是否影响蛋白质翻译、细胞大小和增殖
通过CRISPR-Cas9生成AKAP8L敲除细胞，检测全局蛋白质合成、多聚核糖体谱、细胞大小和增殖，并回补全长或突变AKAP8L进行救援实验。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Sigma | D5796 |
| 胎牛血清 | Sigma | F2442 | |
| 青霉素/链霉素 | Sigma | P0781 | |
| 慢病毒载体 | Addgene | 52962 | |
| 包装质粒 | Addgene | 12259 | |
| 包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| 杀稻瘟菌素 | Life Technologies | A11139-03 | |
| 蛋白质印迹 | 抗S6K抗体 | Cell Signaling | 9202 |
| 抗磷酸化S6K抗体 | Cell Signaling | 9234 | |
| 抗4EBP1抗体 | Cell Signaling | 9452 | |
| 抗Raptor抗体 | Cell Signaling | 2280 | |
| 抗mLST8抗体 | Cell Signaling | 3274 | |
| 抗DEPTOR抗体 | Cell Signaling | 11816 | |
| 抗PRAS40抗体 | Cell Signaling | 2691 | |
| 抗磷酸化CREB抗体 | Cell Signaling | 9198S | |
| 抗CREB抗体 | Cell Signaling | 9197S | |
| 抗肌动蛋白抗体 | Cell Signaling | 3700 | |
| 抗FLAG抗体 | Cell Signaling | 2044 | |
| 抗Myc抗体 | Cell Signaling | 2276 | |
| 抗磷酸化PKA底物抗体 | Cell Signaling | 9624 | |
| 抗磷酸化Akt底物抗体 | Cell Signaling | 9614 | |
| 抗lamin A/C抗体 | Cell Signaling | 2032 | |
| 抗微管蛋白抗体 | Cell Signaling | 2144 | |
| 抗FLAG抗体 | Sigma | F1804 | |
| 抗HA抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7392 | |
| 抗mCherry抗体 | GeneTex | GTX128508 | |
| 抗AKAP8L抗体 | GeneTex | GTX115831 | |
| 抗LARP1抗体 | Bethyl Laboratories | A302-087A | |
| 抗AKAP8抗体 | Bethyl Laboratories | A301-061A | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | GE Healthcare | NXA931V | |
| 辣根过氧化物酶标记二抗 | GE Healthcare | NA934V | |
| 质粒构建 | pcDNA载体 | -- | -- |
| HA-RHA构建体 | Sino Biological | HG17921-NY |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | HEK293A细胞系、培养基类型、血清浓度、抗生素添加、传代条件 阅读提示：Experimental procedures: Cell lines and tissue culture |
| AKAP8L敲除细胞制作 | CRISPR-Cas9 guide RNA序列、转染方法、筛选方法、敲除验证 阅读提示：Experimental procedures: Cell lines and tissue culture; Results: AKAP8L promotes mTORC1-mediated biology |
| 免疫共沉淀 | 抗体、细胞裂解缓冲液、洗涤条件、是否使用交联剂 阅读提示：Results: AKAP8L interacts with mTORC1; Figure 1 legend |
| 多聚核糖体谱分析 | 细胞处理（如Torin1浓度和时间）、蔗糖梯度、离心条件、检测方法 阅读提示：Results: AKAP8L promotes mTORC1-mediated biology; Figure 4 legend |
| 蛋白质合成检测 | 使用35S标记氨基酸、饥饿时间、标记时间、检测方法 阅读提示：Results: AKAP8L promotes mTORC1-mediated biology; Figure 4 legend |
| 细胞大小和增殖检测 | 细胞计数方法、培养时间点、重复次数 阅读提示：Results: AKAP8L promotes mTORC1-mediated biology; Figure 4 legend |