纳米抗体MY1523的制备与体外结合验证
评估MY1523对PD-L1的结合亲和力、特异性及其与治疗性抗体的竞争性。
通过受体结合实验测定125I-MY1523的饱和结合曲线和竞争结合曲线，以及免疫荧光染色验证共定位。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
核素成像引导的PD-L1阻断治疗提高癌症免疫治疗效果
Nuclear imaging-guided PD-L1 blockade therapy increases effectiveness of cancer immunotherapy
实验完整度
高包含体外结合实验、细胞实验、多种荷瘤动物模型（MC-38、A20、4T1）、体内SPECT/CT成像、影像引导治疗及T细胞浸润流式分析，功能与机制验证充分。
主要模型
MC-38结肠癌小鼠模型 A20淋巴瘤小鼠模型 4T1乳腺癌小鼠模型
重点核对
IFN-γ干预剂量与途径：体内1000 IU，瘤内注射，每日一次，连续5天 αPD-L1抗体治疗方案：200 µg，腹腔注射，两次，间隔4天 SPECT/CT成像时间点：注射99mTc-MY1523后2小时 治疗时间窗口确定：根据SPECT/CT成像显示肿瘤PD-L1表达上调的时间点（接种后第8天和第12天） 肿瘤体积评估：每周两次，计算体积=长×宽×高/2
摘要
目的：提高程序性死亡-1(PD-1)/程序性死亡配体-1(PD-L1)检查点阻断治疗的反应性仍然是癌症免疫治疗的重要课题。在本研究中，我们开发了一种新的基于纳米抗体的放射性标记成像探针99mTc-MY1523，靶向PD-L1，通过99mTc-MY1523 SPECT/CT成像的引导来增强PD-L1阻断免疫治疗的疗效。方法：在体外测量了纳米抗体MY1523的结合亲和力和特异性。通过Sortase-A的位点特异性转肽反应将MY1523用99mTc放射性标记，并在携带不同肿瘤的小鼠中进行生物分布和单光子发射CT(SPECT)/CT显像。我们使用干扰素-γ(IFN-γ)作为干预手段建立不同PD-L1表达水平的动物模型，然后研究99mTc-MY1523 SPECT/CT体内无创测量肿瘤PD-L1表达的能力。最后，在MC-38、A20和4T1荷瘤小鼠模型中进行99mTc-MY1523 SPECT/CT引导的PD-L1阻断免疫治疗，并检测肿瘤浸润T细胞。结果：MY1523对PD-L1具有高结合亲和力和特异性，且与治疗性抗体无竞争性结合。99mTc-MY1523以高比活度和放射化学纯度制备。研究发现，在MC-38、A20和4T1荷瘤小鼠模型中，IFN-γ干预可动态上调肿瘤PD-L1表达，如99mTc-MY1523 SPECT/CT所示。在由99mTc-MY1523 SPECT/CT成像确定的治疗时间窗口内启动的PD-L1阻断治疗在所有动物模型中均显著增强了治疗效果，肿瘤生长得到有效抑制，小鼠生存时间明显延长。研究揭示了动态上调的PD-L1表达与改善的PD-L1阻断治疗效果之间的相关性，并在影像引导治疗后验证了肿瘤内效应T细胞浸润显著增加。结论：我们的结果表明，99mTc-MY1523 SPECT/CT能够实时、定量和动态地绘制体内PD-L1表达，影像引导的PD-L1阻断免疫治疗显著提高了治疗效果。该策略值得转化为临床实践，以更好地管理与放疗或化疗的联合治疗。关键词：免疫治疗，程序性细胞死亡1受体，免疫逃逸，CD8阳性T淋巴细胞，免疫调节
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过无创成像动态监测肿瘤PD-L1表达，并据此确定PD-L1阻断治疗的最佳时间窗，以提高治疗效果？
- 核心机制
- IFN-γ通过上调肿瘤细胞和树突状细胞上的PD-L1表达，增强PD-L1阻断治疗的疗效，增加CD8+ T细胞浸润和CD8+/Treg比值。
- 主要证据
- 在MC-38、A20和4T1三种荷瘤模型中，SPECT/CT成像显示IFN-γ干预后肿瘤对99mTc-MY1523的摄取增加，且与PD-L1表达相关；影像引导的αPD-L1治疗显著抑制肿瘤生长并延长生存期，流式细胞术证实CD8+ T细胞浸润增加。
- 研究意义
- 该策略有望转化为临床实践，用于更好地管理PD-L1阻断与放疗或化疗的联合治疗，尤其对PD-L1阻断治疗反应不佳的患者具有潜在价值。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
99mTc-MY1523的制备与体外评价
通过Sortase-A位点特异性转肽反应制备放射性标记纳米抗体，并验证其结合活性和稳定性。
两步标记法制备99mTc-HYNIC-G4K，再与MY1523反应生成99mTc-MY1523；纯化后测定放射化学纯度、稳定性、A20细胞结合亲和力。
99mTc-MY1523的生物分布与特异性验证
评估99mTc-MY1523在荷瘤小鼠体内的生物分布特性及其对PD-L1的靶向特异性。
MC-38荷瘤小鼠静脉注射190 kBq 99mTc-MY1523，在不同时间点（1、2、4小时）取血、肿瘤和组织，测定%ID/g；阻断组共注射200 µg冷MY1523。
SPECT/CT成像监测IFN-γ诱导的PD-L1动态变化
验证99mTc-MY1523 SPECT/CT能否无创监测肿瘤PD-L1表达的上调。
对MC-38、A20和4T1荷瘤小鼠进行IFN-γ干预（瘤内注射1000 IU，每日一次，连续5天），然后注射18 MBq 99mTc-MY1523，2小时后SPECT/CT成像，量化肿瘤摄取，并与离体流式细胞术测定的PD-L1表达进行相关性分析。
影像引导的PD-L1阻断治疗
在三种肿瘤模型中，根据SPECT/CT成像确定的上调PD-L1表达时间窗，启动αPD-L1抗体治疗，评估其抗肿瘤疗效。
在肿瘤细胞接种后第4天开始给予IFN-γ或PBS瘤内注射，第8天和第12天进行SPECT/CT成像，观察到肿瘤摄取增加后给予αPD-L1抗体（200 µg，腹腔注射，两次，间隔4天）。测量肿瘤体积和生存期，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润T细胞。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 放射性标记 | 分选酶A | Detai Biologics Co, Ltd | -- |
| 三苯基膦三磺酸钠 | J&K Chemical Ltd | -- | |
| 三(羟甲基)甲基甘氨酸 | J&K Chemical Ltd | -- | |
| 高锝酸钠 | HTA Co, Ltd | -- | |
| 碘化钠 | Perkin Elmer Inc | -- | |
| Iodo-Gen（1,3,4,6-四氯-3α,6α-二苯基甘脲） | Sigma | -- | |
| G4K(HYNIC)-OH | GL Biochem Ltd | -- | |
| 放射性标记纯化 | Superose 12凝胶色谱柱 | GE Healthcare Life Science | -- |
| Superdex-75凝胶色谱柱 | GE Healthcare Life Science | -- | |
| 放射性标记质量控制 | ITLC-硅胶 | Agilent | -- |
| 放射性薄层成像扫描仪 | Bioscan | AR-2000 | |
| 自动γ计数器 | PerkinElmer Inc | -- | |
| 受体结合实验 | 重组小鼠PD-L1蛋白 | Sino Biological | 50010-M08H |
| 治疗干预 | 抗PD-L1抗体（克隆10F.9G2） | BioXcell | -- |
| IFN-γ干预 | 重组小鼠干扰素-γ | Peprotech | -- |
| 流式细胞术 | PD-L1抗体（克隆MIH5，Cat. 12-5982-82） | eBioscience | 12-5982-82 |
| CD45抗体（Cat. 56-0451-82） | eBioscience | 56-0451-82 | |
| CD19抗体（Cat. 115512） | Biolegend | 115512 | |
| CD11c抗体（Cat. 15-0114-82） | -- | 15-0114-82 | |
| MHC-II抗体（Cat. 25-5321-82） | eBioscience | 25-5321-82 | |
| CD3e抗体（Cat. 25-0031-82） | eBioscience | 25-0031-82 | |
| CD4抗体（Cat. 45-0042-82） | eBioscience | 45-0042-82 | |
| CD8a抗体（Cat. 11-0081-82） | eBioscience | 11-0081-82 | |
| CD16/32抗体（克隆2.4G2） | BioXcell | -- | |
| IV型胶原酶 | Worthington Bio | -- | |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| FACS Calibur流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| Gallios流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫荧光染色 | 兔抗小鼠PD-L1抗体 | Abcam | ab80276 |
| Dylight 650偶联小鼠抗His6标签IgG | Abcam | ab117504 | |
| Dylight-488偶联山羊抗兔IgG | Abbkine | A23220 | |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| 免疫荧光成像 | TCS SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| SPECT/CT成像 | NanoScan SPECT/CT系统 | Mediso Ltd | -- |
| Nucline软件V.2.0 | Mediso Ltd | -- | |
| 统计分析 | Prism V.7.0软件 | GraphPad Software Inc | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与肿瘤模型建立 | 细胞系来源、培养条件、接种细胞数和动物品系 阅读提示：Materials and methods: Cells and animal models |
| 99mTc-MY1523的放射性标记 | 标记反应体系、反应时间、纯化方法和放射化学纯度 阅读提示：Materials and methods: Preparation of 99mTc-MY1523 |
| IFN-γ干预 | IFN-γ剂量、给药途径、给药频率和持续时间 阅读提示：Materials and methods: IFN-γ intervention |
| SPECT/CT成像 | 注射剂量、成像时间点、图像采集参数和定量方法 阅读提示：Materials and methods: SPECT/CT |
| 影像引导的PD-L1阻断治疗 | αPD-L1抗体剂量、给药途径、给药方案（两次，间隔4天）和肿瘤测量方法 阅读提示：Materials and methods: Imaging-guided PD-L1 blockade therapy |