重组刺突蛋白的表达与纯化
获得不同表达系统产生的全长及亚基刺突蛋白，用于后续糖基化分析。
使用HEK293细胞表达S2P、S1和MS1，昆虫SF9细胞表达SF和SN；S2P由McLellan实验室提供，其他商业购买。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
利用特征离子触发的电子转移/高能碰撞解离（EThcD）质谱法全面分析SARS-CoV-2刺突蛋白的聚糖补体
Comprehensive Analysis of the Glycan Complement of SARS-CoV-2 Spike Proteins Using Signature Ions-Triggered Electron-Transfer/Higher-Energy Collisional Dissociation (EThcD) Mass Spectrometry.
实验完整度
高包含多种重组刺突蛋白构建体的表达与纯化、多种蛋白酶消化、质谱分析及定量比较，并进行了表达系统间对比。
主要模型
SARS-CoV-2预融合稳定刺突蛋白（S2P） SARS-CoV-2刺突蛋白S1亚基 SARS-CoV-2刺突蛋白（SF，昆虫细胞表达） MERS-CoV刺突蛋白S1亚基（MS1）
重点核对
表达系统：HEK293细胞（S2P、S1、MS1）与昆虫SF9细胞（SF、SN） 蛋白酶消化组合：胰蛋白酶、Lys-C+胰凝乳蛋白酶、Asp-N+胰凝乳蛋白酶，每种三个重复 质谱方法：特征离子触发的EThcD，触发离子m/z 204.0867、138.0545、366.1396 数据筛选标准：Byonic评分≥300，且仅在单个重复中检测到的糖肽不计入定量 相对丰度计算：基于肽段峰面积比，取2或3次重复的平均值±标准差
摘要
严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）已导致2019冠状病毒病（COVID-19）的全球大流行。在该病毒表面表达的刺突蛋白高度糖基化，并在感染过程中起关键作用。我们使用特征离子触发的电子转移/高能碰撞解离（EThcD）质谱法对SARS-CoV-2刺突蛋白的N-糖基化谱进行了全面的质谱分析。使用该方法表征了重组胞外域和S1亚基的N-糖基化模式。在胞外域和亚基蛋白的修饰位点上，观察到聚糖类型分布及特定单个聚糖的显著差异。与全长蛋白相比，S1亚基中唾液酸化聚糖的相对丰度可能表明这两种物种的整体结构和功能存在差异。此外，我们比较了不同表达系统（包括人胚胎肾（HEK 293）细胞和草地贪夜蛾（SF9）昆虫细胞）产生的重组刺突蛋白的N-聚糖谱。这些结果为研究SARS-CoV-2病毒蛋白的相互作用以及开发有效的疫苗和治疗药物提供了有用的信息。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- SARS-CoV-2刺突蛋白及其亚基在不同表达系统中的N-糖基化谱存在哪些差异？
- 核心机制
- 文中未明确说明
- 主要证据
- 通过特征离子触发的EThcD质谱分析，鉴定了S2P蛋白21个N-糖基化位点，发现与S1亚基相比，S2P中复合型聚糖占优势，而S1亚基唾液酸化聚糖比例显著升高（19/24 vs 3/24）。
- 研究意义
- 为研究SARS-CoV-2病毒蛋白相互作用以及开发有效疫苗和治疗药物提供了有用信息。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
蛋白质纯度与结构分析
确认蛋白纯度及其寡聚状态，以解释糖基化差异。
通过SDS-PAGE和体积排阻色谱分析蛋白纯度和寡聚状态。
蛋白酶消化
产生适合质谱分析的糖肽，并通过多种酶组合提高位点覆盖率和验证。
使用胰蛋白酶、Lys-C+胰凝乳蛋白酶、Asp-N+胰凝乳蛋白酶三种条件消化蛋白，每种三个重复。
LC-MS/MS质谱分析
识别并量化糖肽，确定糖基化位点和聚糖类型。
采用nanoLC-MS/MS，数据依赖的HCD触发EThcD方法。
数据分析与糖基化定量
从质谱数据中鉴定糖肽并计算位点特异性聚糖相对丰度。
使用PMi-Byonic和PMi-Byologic软件，数据库搜索，手动验证。
糖基化谱比较
比较不同构建体和表达系统之间的N-糖基化谱差异。
对比S2P与S1、SF与SN等的糖基化类型和位点特异性聚糖。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质电泳 | NuPAGE Novex Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- |
| GelCode Blue安全蛋白染色剂 | Thermo Scientific | Cat. no. 243596 | |
| 体积排阻色谱 | 安捷伦1200高效液相色谱系统 | Agilent Technologies | -- |
| 安捷伦BioSEC-3体积排阻色谱柱 | Agilent Technologies | -- | |
| Acquity BEH 450蛋白质标准品 | Waters Corporation | -- | |
| 蛋白酶消化 | 胰蛋白酶 | Promega | -- |
| 胰凝乳蛋白酶 | Promega | -- | |
| 天冬酰胺内肽酶 | Promega | -- | |
| 赖氨酰内肽酶 | Promega | -- | |
| RapiGest SF表面活性剂 | Waters Corporation | -- | |
| 蛋白质消化还原 | 二硫苏糖醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| 质谱分析 | Orbitrap Eclipse Tribrid三合一质谱仪 | Thermo Scientific | -- |
| UltiMate 3000 RSLCnano色谱系统 | Thermo Scientific | -- | |
| EASY-Spray PepMap RSLC C18色谱柱 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白表达 | 表达系统：S2P由HEK293细胞表达，SF由昆虫SF9细胞表达 阅读提示：实验部分，Materials |
| 蛋白酶消化 | 蛋白量：0.4-0.7 μg；酶与底物比：胰蛋白酶1/20，Asp-N或Lys-C 1/20，胰凝乳蛋白酶1/5；消化温度和时长 阅读提示：实验部分，Digestion of Spike Proteins |
| LC-MS/MS分析 | 色谱梯度、流速、柱温、喷雾电压、Orbitrap分辨率、触发离子、EThcD参数 阅读提示：实验部分，Mass Spectrometry Analysis |
| 数据筛选与定量 | Byonic评分阈值、前体和碎片质量容忍度、手动验证标准、重复次数 阅读提示：实验部分，Data Analysis |