鉴定可溶性人种系IGHV等位基因
寻找具有良好生物物理特性的人源VH框架作为单域抗体支架。
从IMGT数据库鉴定17个人种系IGHV等位基因，并在大肠杆菌中表达和表征其产量、稳定性、聚集温度等。
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鉴定针对SARS-CoV-2的全人源单域抗体
Identification of Human Single-Domain Antibodies against SARS-CoV-2.
实验完整度
高研究包含体外抗体库构建、生物淘选、结合和中和实验，以及结构建模和表位作图等多层级验证，但缺乏体内动物模型验证。
主要模型
人源单域抗体库 SARS-CoV-2 RBD蛋白 SARS-CoV-2 S1蛋白 Vero E6细胞 Huh-7细胞
重点核对
抗体库的多样性和质量验证 抗体的结合特异性 抗体的中和活性（假病毒和活病毒）
摘要
Wu等人描述了一种快速分离全人源单域抗体的多功能平台的开发，并将该方法应用于鉴定SARS-CoV-2特异性抗体。这些人类单域抗体靶向SARS-CoV-2刺突蛋白受体结合域（RBD）内的多个表位，可能为COVID-19提供潜在的治疗候选药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何快速开发针对SARS-CoV-2的全人源单域抗体，并鉴定其表位和中和活性。
- 核心机制
- 部分中和抗体（如n3088和n3130）靶向刺突蛋白三聚体界面上的隐秘表位，与CR3022结合表征相关但可能因尺寸优势而更有效。
- 主要证据
- 通过噬菌体展示抗体库筛选出18个RBD结合抗体和5个S1结合抗体，其中D组抗体n3088和n3130在假病毒和活病毒中和实验中显示出低微克级IC50值，且表位作图显示其关键残基位于CR3022表位内。
- 研究意义
- 全人源单域抗体具有低免疫原性、快速生产和吸入给药的潜力，可能成为COVID-19预防和治疗的候选药物，并有助于疫苗开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建全人源单域抗体库
基于3-66*01框架，通过CDR移植建立大容量噬菌体展示库。
从多个天然抗体库中克隆CDR，通过重叠延伸PCR嫁接至3-66*01框架，构建文库并验证其质量和多样性。
鉴定SARS-CoV-2特异性单域抗体
从抗体库中筛选靶向SARS-CoV-2 RBD和S1的抗体。
使用生物素化的RBD和S1蛋白进行生物淘选，通过ELISA和BLI评估结合，并进行竞争分组。
中和抗体的鉴定和表位定位
评估抗体的中和活性并定位其表位。
通过假病毒和活病毒中和实验测定IC50，使用竞争BLI和丙氨酸扫描定位表位。
结构建模和功能分析
解释中和抗体识别隐秘表位的机制。
使用SWISS-MODEL、Z-dock等预测n3088与spike复合物结构，比较CR3022结合。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体表达和纯化 | pComb3x载体 | Addgene | Cat# 63891 |
| 多粘菌素B硫酸盐 | Sigma-Aldrich | Cat# P1004-5MU | |
| Ni Sepharose高性能填料 | GE Healthcare | Cat# 17526802 | |
| Amicon超滤离心管 | Millipore | -- | |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher | -- | |
| 生物物理性质表征 | Uncle/UNit系统 | Unchained Labs | -- |
| 蛋白质纯度和聚集分析 | Waters AQUITY UPLC H-class系统 | Waters | -- |
| TSK-Gel Super SW3000色谱柱 | TSK-GEL | -- | |
| 抗体库构建 | 高保真PCR预混液 | Roche | Cat# 12140314001 |
| SfiI限制酶 | New England Biolabs | Cat# R0123L | |
| M13KO7辅助噬菌体 | Thermo Fisher | Cat# 18311019 | |
| 生物淘选 | Dynabeads MyOne链霉亲和素T1磁珠 | Thermo Fisher | Cat# 65601 |
| 生物素化人TIM-3/HAVCR2 | ACROBiosystems | Cat# TM3-H82E7 | |
| 人IL-33 | ACROBiosystems | Cat# IL3-H52H7 | |
| 人TPBG/5T4 | ACROBiosystems | Cat# TPG-H52E5 | |
| 人TNF-α | Sino Biological Inc. | Cat# 10602-HNAE | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白S1-His | Sino Biological Inc. | Cat# 40591-V08H | |
| SARS-CoV-2刺突蛋白RBD-His | Sino Biological Inc. | Cat# 40592-V08B | |
| BLI结合实验 | ACE2-His蛋白 | Novoprotein Scientific Inc. | Cat# C419 |
| ELISA | ABTS底物 | Thermo Fisher | Cat# 002024 |
| 单克隆抗FLAG M2-过氧化物酶（HRP）抗体 | Sigma-Aldrich | Cat# A8592-1MG | |
| 抗M13-辣根过氧化物酶多克隆抗体 | Pharmacia | Cat# 27-9421 | |
| 假病毒中和实验 | Bright-Glo荧光素酶检测系统 | Promega | Cat# E2620 |
| 活病毒中和实验 | 细胞计数试剂盒-8 | Dojindo | Cat# CK04-20 |
| 蛋白质表达 | Expi293表达系统 | Thermo Fisher | Cat# A14635 |
| 细胞培养 | Vero E6细胞 | ATCC | Cat# CRL-1586 |
| 蛋白质表达 | pSecTag2B表达载体 | Thermo Fisher | Cat# V90020 |
| 蛋白质生物素化 | BirA500试剂盒 | Avidity | -- |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-LC-生物素 | Thermo Fisher | Cat# A35358 | |
| 蛋白质纯化 | 蛋白G Sepharose 4 Fast Flow树脂 | GE Healthcare | Cat# 17061805 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 抗体库构建 | CDR来源文库、框架序列、文库大小 阅读提示：Method Details中Construction of Human Single-Domain Antibody Library |
| 生物淘选 | 靶抗原（RBD/S1）、生物素化方法、磁珠类型、淘选轮次 阅读提示：Method Details中Antibody Screening from Phage Library |
| BLI结合实验 | 抗原固定化方法、抗体浓度、缓冲液 阅读提示：Method Details中Biolayer Interferometry (BLI) Binding Assays |
| 竞争结合实验 | 第一抗体的饱和浓度、第二抗体的浓度、ACE2浓度 阅读提示：Method Details中Binding Competition Assays |
| 假病毒中和实验 | 假病毒构造、细胞系、抗体孵育时间、感染时间 阅读提示：Method Details中Pseudotyped Virus Neutralization |
| 活病毒中和实验 | 病毒株、用量、细胞系、抗体浓度、检测时间 阅读提示：Method Details中Live Virus Microneutralization Assay |