临床队列建立与随访
评估抗TNF撤药与继续治疗在UC患者中的临床结局。
BIOSTOP研究共入组163例UC患者，按1:1随机分配至抗TNF撤药组（82例）或继续治疗组（81例），随访2年，定期评估临床疾病活动度。
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溃疡性结肠炎抗肿瘤坏死因子撤药后与继续治疗相比的黏膜纵向转录组分析
Longitudinal transcriptomic analysis of mucosa in ulcerative colitis after anti-tumor necrosis factor withdrawal compared to continued treatment
实验完整度
高文献包含多种独立证据层级：纵向临床队列（163例）结合批量RNA-seq分析、细胞类型反卷积、差异表达和通路富集分析，并验证了转录组与组织学炎症（RHI）的相关性。
主要模型
直肠黏膜活检组织（来自BIOSTOP队列） UC患者队列（163例） 抗TNF撤药组（82例）及继续治疗组（81例）
重点核对
基线活检转录组是否无法区分复发与缓解（PCA和差异表达分析） 复发或发作时炎症基因表达谱（如CXCL9、CXCL10）是否上调 细胞类型组成变化（如单核细胞/巨噬细胞和THY1+ FAP+ PDPN+成纤维细胞）在复发或发作时是否增加 THF及受体（TNFRSF1A、TNFRSF1B）表达在复发或发作时的变化 组织学炎症（RHI）与转录组标志物（如FPR2、FCGR3B）的相关性
摘要
背景与目的：抗肿瘤坏死因子（抗TNF）单克隆抗体是治疗中度至重度溃疡性结肠炎（UC）的有效药物。目前尚不清楚此类治疗是否可以安全停药而不复发。本研究旨在识别可预测患者能否成功停用抗TNF治疗的生物标志物，并加深我们对停药后复发和继续治疗期间疾病发作的发病机制的理解。方法：我们分析了来自BIOSTOP研究中163例患者在基线、2年（研究结束）以及发作或复发时间点收集的直肠黏膜活检组织的纵向批量RNA测序数据。结果：在该队列中，撤药前的转录组谱不能区分后来复发的患者与维持长期缓解的患者。对复发或发作患者的纵向分析均显示炎症基因表达谱（如CXCL9、CXCL10、OSMR、SELE）以及活动性UC典型的细胞类型组成变化（如单核细胞/巨噬细胞和THY1+ FAP+ PDPN+活化成纤维细胞）。两组均显示T细胞相关转录特征的富集，包括CD8 T细胞相关基因和IL-17相关通路。此外，两组患者均显示替代治疗药物靶标的表达增加，提示对特定患者亚群可能存在治疗选择。结论：我们的发现为抗TNF撤药后复发和继续治疗期间疾病发作的炎症机制提供了见解。该数据集为未来改善UC个性化治疗策略的研究提供了宝贵资源。关键词：溃疡性结肠炎，抗TNF撤药，基因表达。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否通过基线黏膜转录组预测抗TNF撤药后的复发，以及撤药后复发和继续治疗期间发作的分子机制是什么？
- 核心机制
- 复发和发作均与活动性UC典型的炎症反应相关，包括先天免疫激活（涉及NF-κB、Toll样受体信号）和T细胞相关反应（CD8 T细胞、IL-17相关通路）；THF信号通路在复发和发作时均富集。
- 主要证据
- 基于BIOSTOP队列的纵向RNA测序数据，差异表达分析显示复发和发作时数百个基因上调；细胞类型反卷积显示炎症细胞比例增加；通路富集分析显示炎症通路激活；RHI与转录组标志物相关。
- 研究意义
- 该数据集为理解抗TNF撤药后复发和继续治疗期间发作的机制提供了资源，可能有助于改善UC的个性化治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
样本采集与RNA提取
获取直肠黏膜活检用于转录组分析。
在基线、2年随访及疑似复发时采集直肠黏膜活检，立即保存于RNAprotect Cell Reagent并冷冻，随后进行RNA提取和质控。
RNA测序与数据处理
获得基因表达谱。
构建链特异性文库，在Illumina NovaSeq 6000平台进行PE150测序，生成约3000万读段对/样本。原始数据经nf-core/rnaseq流程进行质量控制、比对和定量。
差异表达分析
比较不同时间点和组间的基因表达差异。
使用DESeq2分析基线、复发/发作和随访时的差异表达基因，调整性别和患者ID等协变量，采用配对设计。
通路富集分析
识别差异表达基因涉及的生物学通路。
使用clusterProfiler对差异表达基因进行KEGG、GO和Reactome通路富集分析。
细胞类型反卷积
估计活检组织中细胞类型成分的变化。
使用omnideconv工具，以IBD患者肠道单细胞RNA-seq图谱为参考，采用DWLS算法估计21种细胞类型的比例。
与组织学炎症关联分析
验证转录组变化与组织学炎症的相关性。
计算RHI评分，并与关键基因表达和细胞类型估计进行相关性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
RNA测序与数据处理
通路富集分析
细胞去卷积
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| RNA保存 | RNAprotect细胞试剂 | Qiagen | 76526 |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 组织裂解 | 1/4英寸陶瓷珠 | MP biomedicals | 6540-424 |
| FastPrep-24 | MP biomedicals | -- | |
| RNA纯化 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74106 |
| RNA质控 | Agilent 5400片段分析仪系统 | Agilent Technologies | -- |
| 文库制备 | Novogene NGS链特异性RNA文库制备套装（PT044） | Novogene | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者纳入标准 | UC诊断、连续抗TNF治疗至少1年、临床缓解至少3个月、连续两次粪钙卫蛋白<200 µg/g、Mayo内镜评分0-1 阅读提示：Methods: 2.1 Patient cohort and tissue samples |
| 随机分组 | 撤药组（82例）和继续治疗组（81例） 阅读提示：Methods: 2.1 Patient cohort and tissue samples |
| 活检采集 | 直肠活检，时间点包括基线、2年随访和疑似复发时 阅读提示：Methods: 2.1 Patient cohort and tissue samples |
| RNA提取和测序 | RNA提取试剂：TRIzol和RNeasy Mini kit；测序平台：Illumina NovaSeq 6000；读长：PE150 阅读提示：Methods: 2.2 Tissue dissociation and RNA isolation; 2.3 Library preparation and bulk mRNA-seq |
| 差异表达分析 | DESeq2参数、显著性阈值（adjusted P < 0.05且|log2FC| > 1）、配对设计（PtID + Timepoint） 阅读提示：Methods: 2.5 Differential gene expression analysis |
| 细胞去卷积 | 参考单细胞图谱：人类IBD肠道图谱；算法：DWLS 阅读提示：Methods: 2.7 Cell-type deconvolution |