F. nucleatum感染小鼠和细胞模型建立
模拟F. nucleatum定植和感染，观察其对结肠炎的影响
C57BL/6J小鼠经链霉素预处理后，灌胃F. nucleatum或PBS 2周，再给予3% DSS 7天诱导结肠炎；NCM460细胞用F. nucleatum感染不同时间。
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具核梭杆菌通过乙酰辅酶A蓄积诱导的STAT3激活加剧结肠炎
Fusobacterium nucleatum exacerbates colitis via STAT3 activation induced by Acetyl-CoA accumulation
实验完整度
高包含体外细胞实验、肠上皮特异性Stat3敲除小鼠模型、DSS诱导结肠炎小鼠模型及临床样本分析，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠DSS诱导结肠炎模型 NCM460细胞系 Stat3ΔIEC小鼠 溃疡性结肠炎患者结肠组织
重点核对
F. nucleatum菌株ATCC 25586，感染剂量109 CFU/ml DSS浓度3%（w/v） C646剂量5 mg/kg/d腹腔注射 ETC-1002剂量20 mg/kg/d SB204990剂量37.5 mg/kg/d
摘要
具核梭杆菌已成为溃疡性结肠炎（UC）发病机制的潜在促成因素，尽管其具体机制仍未完全阐明。本研究证明，具核梭杆菌通过破坏肠屏障完整性、诱导上皮细胞凋亡以及调节炎症通路来促进结肠炎。此外，我们证明具核梭杆菌促进STAT3在K685位点的乙酰化，随后在Y705位点磷酸化，从而增强其转录活性并加剧结肠炎严重程度。另外，具核梭杆菌介导的乙酰辅酶A水平上调是STAT3乙酰化的原因，将代谢过程与UC病理生理学联系起来。药理学抑制乙酰辅酶A的产生可有效减轻实验模型中具核梭杆菌诱导的结肠炎，提示靶向这些通路的潜在治疗策略。这些发现揭示了具核梭杆菌相关UC进展中的一条新型调控通路，并为未来UC的预防和治疗提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 具核梭杆菌通过何种机制加剧溃疡性结肠炎？
- 核心机制
- F. nucleatum通过上调肠上皮细胞中乙酰辅酶A水平，促进STAT3 K685乙酰化，进而增强Y705磷酸化和核转位，导致肠屏障破坏、细胞凋亡和炎症加剧。
- 主要证据
- 基于DSS诱导结肠炎小鼠模型、NCM460细胞、Stat3敲除小鼠和患者样本，通过Western blot、免疫荧光、TUNEL等实验证明F. nucleatum上调乙酰辅酶A并激活STAT3通路。
- 研究意义
- 为UC发病机制提供新见解，提示靶向乙酰辅酶A代谢可能成为UC治疗的新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证F. nucleatum对肠屏障和细胞凋亡的作用
检测F. nucleatum是否破坏肠屏障和诱导凋亡
通过HE染色、AB-PAS染色、免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin，TUNEL染色检测凋亡，Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达。
验证STAT3磷酸化在F. nucleatum加剧结肠炎中的作用
确定F. nucleatum是否通过STAT3磷酸化促进炎症
检测小鼠结肠和NCM460细胞中p-STAT3Y705表达，使用Stat3敲除小鼠和shSTAT3细胞，以及Stattic抑制剂处理，观察炎症因子水平和肠屏障变化。
验证STAT3乙酰化在F. nucleatum加剧结肠炎中的作用
探究F. nucleatum是否通过STAT3 K685乙酰化促进磷酸化
检测ac-STAT3K685表达，使用C646（p300/CBP抑制剂）和SRT1720（SIRT1激活剂）处理细胞和小鼠，观察ac-STAT3、p-STAT3及下游效应；构建K685R突变体验证。
验证乙酰辅酶A在F. nucleatum诱导STAT3激活中的作用
探究F. nucleatum是否通过上调乙酰辅酶A促进STAT3乙酰化
测量细胞和小鼠结肠中乙酰辅酶A水平，western blot检测乙酰化组蛋白H3，使用ACLY抑制剂ETC-1002和SB204990处理，观察乙酰辅酶A下游效应。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | 苛养厌氧菌肉汤 | Topbio | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Cytiva | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 细胞转染 | Hieff Trans脂质体转染试剂 | Yeasen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Servicebio | -- |
| 磷酸酶抑制剂混合物 | Servicebio | -- | |
| 去乙酰化酶抑制剂 | Beyotime | -- | |
| 蛋白分离 | 细胞质蛋白提取试剂盒 | Beyotime | P0027 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | #P0012-1 |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| ChemiDoc XRS+成像系统 | BIO-RAD | -- | |
| STAT3抗体 | CST | #124H6 | |
| 磷酸化STAT3（Y705）抗体 | CST | #D3A7 | |
| 乙酰化STAT3（K685）抗体 | CST | #2523 | |
| Occludin抗体 | Proteintech | 27260-1-AP | |
| Bcl-2抗体 | AbMART | T40056 | |
| Bax抗体 | Proteintech | 50599-2-Ig | |
| TLR4抗体 | Santa Cruz | sc-293072 | |
| TLR9抗体 | Abclonal | A14642 | |
| HA标签抗体 | Proteintech | 51064-2-AP | |
| 乙酰化组蛋白H3（K9）抗体 | AbMART | P37961-16 | |
| 组蛋白H3抗体 | Proteintech | 68345-1-Ig | |
| Lamin B1抗体 | Proteintech | 12987-1-AP | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 60004-1-Ig | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| MiniBEST通用RNA提取试剂盒 | TaKaRa | 9767 | |
| 逆转录 | Evo M-MLV逆转录试剂盒 | Accurate Biology | AG11705 |
| qRT-PCR | Taq Pro通用SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q712-02 |
| BIO-RAD CFX Connect实时荧光定量PCR仪 | BIO-RAD | -- | |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Beyotime | -- |
| 多功能酶标仪 | Ensight多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- |
| 免疫组化 | UltraSensitive SP（小鼠/兔）免疫组化试剂盒 | Maxib | -- |
| Muc-2抗体 | Abcam | ab272692 | |
| AB-PAS染色 | AB-PAS染色试剂盒 | Solarbio | G1285 |
| 免疫荧光 | 含DAPI的抗荧光淬灭封片剂 | Beyotime | P0131 |
| ZO-1抗体 | Abcam | ab221547 | |
| Cy3标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0516 | |
| Cy3标记的山羊抗小鼠IgG（H+L） | Beyotime | A0521 | |
| FITC标记的山羊抗兔IgG（H+L） | Beyotime | A0562 | |
| 凋亡检测 | 一步法TUNEL凋亡检测试剂盒 | Beyotime | C1090 |
| 电镜 | HT7800透射电子显微镜 | HITACHI | -- |
| 肠通透性检测 | FITC-葡聚糖（FD4） | Sigma-Aldrich | -- |
| IVIS Lumina III小动物活体成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| FISH | 通用细菌DNA FISH试剂盒 | Focobio | D-0016 |
| 乙酰辅酶A检测 | 乙酰辅酶A ELISA试剂盒 | Shanghai Yiyan Biotech | EY12009 |
| 药物处理 | Stattic抑制剂 | -- | -- |
| C646抑制剂 | -- | -- | |
| SRT1720激活剂 | -- | -- | |
| ETC-1002抑制剂 | -- | -- | |
| SB204990抑制剂 | -- | -- | |
| TAK-242抑制剂 | -- | -- | |
| 乙酸钠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细菌培养与感染 | F. nucleatum菌株（ATCC 25586），感染剂量109 CFU/ml，感染时间2周（小鼠），MOI=100（细胞） 阅读提示：Methods: Bacterial strains and cell lines; Induction of colitis |
| 结肠炎诱导 | DSS浓度3%（w/v），给予时间7天，链霉素预处理剂量2 mg/ml共3天 阅读提示：Methods: Induction of colitis |
| STAT3敲除/敲低 | Stat3ΔIEC小鼠模型，shSTAT3稳定敲低NCM460细胞，嘌呤霉素筛选浓度2μg/mL 阅读提示：Methods: Mice; Cell transfection |
| 药物处理 | Stattic浓度1μM，C646浓度5μM（细胞）和5 mg/kg/d（小鼠），SRT1720浓度10μM，ETC-1002浓度10μM（细胞）和20 mg/kg/d（小鼠），SB204990 37.5 mg/kg/d，处理时间12小时（细胞） 阅读提示：Results: 图4C-E, 图5G-H, 图6A, 图7F, 图8A |
| 肠屏障功能检测 | FITC-葡聚糖浓度80 mg/mL，灌胃体积200μL，检测时间4小时，荧光检测波长Ex/Em 485/530 nm 阅读提示：Methods: Assessment of intestinal barrier integrity |