临床患者获得性耐药基因组分析
识别PDAC患者对达拉哌西布获得性耐药的基因组改变。
收集44例RAS突变转移性PDAC患者的配对治疗前及治疗结束时ctDNA，利用Guardant Health Infinity NGS panel进行800+基因靶向测序。
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对RAS(ON)多选择性抑制剂达拉哌西布的获得性耐药指导胰腺癌的合理联合治疗策略
Acquired resistance to the RAS(ON) multi-selective inhibitor daraxonrasib guides rational combination therapy strategies in pancreatic cancer
实验完整度
高包含临床样本ctDNA分析、体外细胞活力实验、异种移植瘤模型、GEMM模型等多层级证据，并进行了功能验证和机制研究。
主要模型
HuP-T3 PDAC细胞系 AP009小鼠胰腺类器官来源细胞系 Capan-1、HPAC、HPAF-II、KP-4、PSN-1、MIA Paca-2等CDX模型 KPC/Y GEMM来源的同种移植瘤模型 WU-0002和WU-0022患者来源异种移植瘤(PDX)模型
重点核对
配对ctDNA样本中获得的获得性基因组改变，包括KRAS扩增、RTK改变等 KRAS扩增与TP53突变共发生的显著关联（P=0.03） RMC-7977或达拉哌西布耐药的CDX模型建立方法 达拉哌西布剂量（25 mg/kg po qd）和zoldonrasib剂量（100 mg/kg po qd） 联合治疗中T-DXd的给药方案（4 mg/kg或10 mg/kg i.v. 每周）
摘要
达拉哌西布是一种口服生物可利用的RAS(ON)多选择性三复合物抑制剂，靶向N、H和KRAS的致癌突变型和野生型变体。我们此前在一项1/2期临床试验中报告了达拉哌西布单药治疗既往经治的RAS突变转移性胰腺腺癌（PDAC）患者在临床活性剂量水平下的令人鼓舞的疗效，为随机3期RASolute 302临床试验中的验证性评估提供了基础。在此，我们通过靶向测序分析了1/2期临床试验中44例患者的配对治疗前和治疗结束时的循环肿瘤DNA样本中超过800个基因，报告了达拉哌西布单药治疗获得性耐药机制。在超过一半（26/44；59%）的患者中观察到RAS信号通路中新出现的基因组改变，其中最重要的是突变型KRAS扩增（16/44；36%），以及受体酪氨酸激酶（RTK）（4/44；9%）、MAPK（11/44；25%）和PI3K（4/44；9%）通路的改变。值得注意的是，未观察到获得性KRAS继发突变，这与突变选择性KRAS G12C(OFF)抑制剂的耐药谱不同。为了证实这些临床发现，我们在人源和鼠源PDAC临床前模型中建立了一致的达拉哌西布耐药机制，包括突变型KRAS和MYC扩增及RTK上调，这些改变指导了多种联合治疗概念。值得注意的是，达拉哌西布与靶向DNA损伤反应、RTK或突变选择性RAS(ON) G12D抑制剂佐达拉西布联合使用，在临床前模型中可以避免耐药。总之，这些结果表明，达拉哌西布的大多数基因组耐药机制驱动了RAS通路信号的再激活，并为PDAC中值得进一步研究的潜在联合策略提供了指导。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 达拉哌西布单药治疗胰腺癌的获得性耐药机制是什么，以及如何通过联合治疗来克服或预防这种耐药？
- 核心机制
- 获得性耐药主要通过RAS通路信号过度激活实现，包括突变KRAS扩增、RTK上调和MYC扩增，导致RAS/MAPK信号再激活。
- 主要证据
- 基于44例患者配对ctDNA测序发现KRAS扩增（36%）、RTK改变（9%）等；体内外模型（如Capan-1、HPAF-II）显示KRAS扩增和RTK上调，且联合T-DXd、amivantamab或zoldonrasib可增强抗肿瘤活性。
- 研究意义
- 研究结果为PDAC中达拉哌西布联合RTK靶向生物制剂（如T-DXd、amivantamab）或RAS(ON)抑制剂双药联合（达拉哌西布+zoldonrasib）提供了临床评估依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外模型验证KRAS扩增等耐药机制
验证突变KRAS扩增是否导致RAS信号过度激活并降低达拉哌西布敏感性。
在HuP-T3细胞中诱导KRASG12R过表达，在AP009细胞中过表达KrasG12D，检测达拉哌西布处理后细胞活力和pERK水平。
体内异种移植瘤模型建立与耐药表征
在体内模型中建立获得性耐药，并表征耐药机制。
通过连续传代建立Capan-1和HPAF-II耐药模型，或用HPAC异种移植瘤经RMC-9945治疗获得耐药，检测KRAS扩增和RTK表达。
联合治疗策略评估
测试不同联合方案是否能够克服或预防耐药。
在多种模型中测试达拉哌西布联合DDR抑制剂、RTK靶向药物（如T-DXd）或RAS(ON)抑制剂双药联合（达拉哌西布+zoldonrasib）的抗肿瘤效果。
KPC/Y GEMM模型验证联合预防耐药
在免疫活性模型中评估联合治疗在耐药发生前的预防效果。
使用KPC/Y GEMM来源的同种移植瘤模型，比较单药与联合治疗对肿瘤生长和耐药发生的影响。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | IMDM培养基 | -- | -- |
| EMEM培养基 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| DMEM培养基 | -- | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶-EDTA | -- | -- | |
| 基质胶 | Corning | -- | |
| 药物处理 | 多西环素 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 聚凝胺 | -- | -- | |
| 二甲基亚砜 | Fisher Scientific | 67-68-5 | |
| 秋水仙胺 | GIBCO | -- | |
| RMC-7977 | -- | -- | |
| RMC-9945 | -- | -- | |
| 佐达拉西布 | -- | -- | |
| IAG933 | -- | -- | |
| 阿泽诺替尼 | -- | -- | |
| 埃万妥单抗 | -- | -- | |
| 曲妥珠单抗-德鲁替康 | Gruechem | -- | |
| BBI-355 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo 2.0 试剂 | Promega | -- |
| Envision 酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| Western blot | NP-40 细胞裂解液 | Invitrogen | -- |
| MSD Tris 裂解液 | MSD | -- | |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Thermo | -- | |
| Pierce BCA 蛋白定量试剂盒 | Thermo | -- | |
| LDS 上样缓冲液 | Thermo | -- | |
| 还原剂 | Thermo | -- | |
| 4-12% Bis-Tris 凝胶 | Thermo | -- | |
| 抗KRAS抗体 | Santa-Cruz | -- | |
| 抗泛RAS抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Ras(G12D突变)抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗HER2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗p44/42 MAPK抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗磷酸化MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗MEK1/2抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗Flag抗体 | Abcam | -- | |
| 抗Vinculin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-actin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗β-tubulin抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| IRDye 800CW 山羊抗小鼠IgG | Licor | -- | |
| 山羊抗兔IgG HRP偶联抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 免疫组化 | 抗EpCAM兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | -- |
| 抗HER2兔单克隆抗体 | Gene Tech | -- | |
| BOND IHC聚合物检测试剂盒 | Leica | -- | |
| 抗磷酸化ERK1/2兔单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗广谱细胞角蛋白兔单克隆抗体 | Abcam | -- | |
| MACH4-HRP聚合物检测系统 | Biocare | -- | |
| 抗人Ras兔单克隆抗体 | Cell Signaling | -- | |
| 流式细胞术 | Alexa Fluor 647偶联抗人HER2抗体 | BioLegend | -- |
| FACScan 5 流式细胞仪 | -- | -- | |
| 数字PCR | QIAamp DNA Mini 试剂盒 | QIAGEN | -- |
| DNeasy 血液和组织试剂盒 | QIAGEN | -- | |
| Naica 系统多重数字PCR | Stilla | -- | |
| QuantStudio Absolute Q 数字PCR系统 | Thermo Fisher | -- | |
| dPCR突变检测试剂盒 KRAS WT p.G12C | Apexbio | AA100902-WT | |
| dPCR突变检测试剂盒 KRAS突变 p.G12R | Apexbio | AA100904-MU | |
| Absolute Q 液体活检dPCR检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | A53732 | |
| FISH | KRAS/12号染色体着丝粒探针 | Empire Genomics | KRAS-CON12-REGR |
| Cytobond封片剂 | SciGene | 2020-00-1 | |
| Abbott FFPE预处理试剂盒 | Abbott | -- | |
| 组织解离 | 肿瘤解离试剂盒 | -- | 130-095-929 |
| gentleMACS Octo 组织解离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 全外显子测序 | 全外显子测序 | Azenta | -- |
| RNA-seq | RNA测序 | -- | -- |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | -- | -- |
| 无胸腺裸鼠 | -- | -- | |
| SCID Beige小鼠 | -- | -- | |
| NSG小鼠 | -- | -- | |
| C57BL/6J小鼠 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列和ctDNA分析 | 患者选择标准（RAS突变、剂量160-300mg、PFS>3个月）、ctDNA采样时间点、测序panel（800+基因）、获得性改变的判定标准 阅读提示：Methods: Circulating tumor DNA assessment in patients with acquired resistance; Extended Data Fig. 1 |
| 细胞培养和体外实验 | 细胞系来源、培养基和添加物、多西环素诱导浓度、细胞活力测定时长（5天）、药物浓度范围 阅读提示：Methods: 2D cellular viability assays, Cell line engineering |
| 体内模型 | 小鼠品系和年龄、细胞接种数量、肿瘤起始体积、给药剂量和方案、肿瘤测量方法 阅读提示：Methods: In vivo model development, In vivo treatment |
| 耐药模型建立 | 耐药诱导方式（连续传代、药物浓度）、传代数、耐药确认指标 阅读提示：Methods: In vivo model development, In vitro resistant cell line establishment and characterization |
| 联合治疗评估 | 联合药物剂量和方案、肿瘤体积评估时间点、统计分析 阅读提示：Methods: In vivo treatment, In vivo study data analysis; Fig. 4 and Fig. 5 legends |