诱导衰老模型建立
获得均匀且同步的衰老细胞群体以研究SICC形成。
使用ICM（一种HMGB1/2抑制剂）处理IMR90细胞6天诱导衰老，同时制备复制性衰老细胞（连续传代）和HUVEC衰老模型。
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衰老细胞将CTCF聚集于核斑点以指导选择性剪接程序
Senescent cells cluster CTCF on nuclear speckles to instruct an alternative splicing program
实验完整度
高包含体外细胞模型、超分辨成像、组学分析、功能敲低/过表达、分子动力学模拟等多层级证据，并进行功能验证。
主要模型
IMR90人胚肺成纤维细胞（ICM诱导衰老和复制性衰老） HUVEC人脐静脉内皮细胞（复制性衰老） 人皮肤成纤维细胞（来自年轻和年老供体） 人全血样本（来自年轻和年老供体）
重点核对
ICM诱导衰老条件：10μM ICM处理IMR90细胞6天 BANF1、SRRM2、CTCF的siRNA敲低效率及对SICC形成的影响 SRRM2-RBD过表达诱导CTCF聚集的剂量和时间 1,6-己二醇处理条件：6%浓度处理1分钟 RNA-seq、Micro-C、LoopTrace等组学数据的生物学重复数
摘要
衰老是正常细胞复制寿命的终点，伴随一系列复杂的分子事件。其中之一是CTCF显著重组成衰老诱导的簇（SICCs）。然而，SICCs的分子决定因素、基因组后果和功能目的仍不清楚。在这里，我们结合三维基因组学、超分辨成像、DNA示踪和功能分析以及建模来剖析SICC的出现。我们发现，在进入衰老时，细胞重新利用核斑点的关键组分SRRM2和染色体的“分子胶”BANF1来聚集CTCF并重新连接基因组结构。这种以CTCF为中心、参照核斑点的重组有助于指导衰老剪接程序，因为破坏SICCs几乎完全逆转了选择性剪接模式并延迟了衰老的发生。因此，我们揭示了一种范式，即人类细胞将核生物化学的变化转化为指导剪接选择的架构变化，以致力于衰老的命运。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞衰老过程中CTCF聚集的分子决定因素、基因组后果和功能目的是什么？
- 核心机制
- 衰老细胞中HMGB2核内耗竭，导致CTCF与核斑点组分SRRM2和BANF1相互作用增强，CTCF在核斑点周围形成SICCs，进而重塑三维基因组结构并指导衰老相关的选择性剪接程序，促进衰老进程。
- 主要证据
- 通过Co-IP/MS鉴定CTCF衰老特异性相互作用蛋白，siRNA敲低和过表达实验验证BANF1和SRRM2的必要性和充分性，Micro-C和LoopTrace显示衰老相关环路的形成，RNA-seq分析揭示SICCs解聚逆转衰老相关剪接模式，活细胞成像显示SICC解聚延迟衰老。
- 研究意义
- 揭示了细胞核生物化学变化转化为基因组结构变化以指导剪接选择并决定衰老命运的范式，可能为调节衰老提供潜在靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定CTCF衰老特异性相互作用蛋白
寻找促进CTCF聚集的分子组分。
对增殖和衰老IMR90细胞进行CTCF Co-IP结合质谱分析，鉴定差异互作蛋白，并验证1,6-己二醇对SICCs的影响。
验证BANF1和SRRM2对SICC形成的作用
确定BANF1和SRRM2是否是SICC形成的必要和/或充分条件。
通过siRNA敲低BANF1或SRRM2观察SICC形成变化；通过过表达BANF1或SRRM2的RNA结合域（RBD）检测能否诱导SICC形成。
分析HMGB2缺失对CTCF聚集的影响
探究HMGB2核内耗竭如何触发CTCF聚集。
在衰老细胞中过表达全长HMGB2、其box A结构域或酸性尾部，检测SICC形成；通过Co-IP-MS鉴定HMGB2相互作用蛋白，并分析HMGB2和SON的基因组结合情况。
评估SICCs对三维基因组结构的影响
确定SICC形成是否导致衰老特异性的染色质环路重组。
使用Micro-C和LoopTrace分析增殖和衰老细胞的三维基因组结构，并与CTCF、SON和HMGB2结合谱关联。
验证SICCs对选择性剪接程序的影响
确定SICCs是否指导衰老相关的选择性剪接程序。
对衰老细胞、SICC相关因子敲低细胞进行RNA-seq，分析剪接事件变化，并检查与衰老和老化样本的共享剪接事件。
评估SICC解聚对衰老进程的影响
确定SICC形成是否与衰老停滞相关。
在衰老细胞中敲低SRRM2、BANF1或CTCF，通过活细胞成像监测细胞增殖情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- | |
| Endopan-2培养基 | Pan Biotech | -- | |
| 诱导衰老 | Inflachromene | Cayman Chemicals | -- |
| 药物处理 | 1,6-己二醇 | Sigma-Aldrich | -- |
| Tautomycetin | Merck | 58551 | |
| 细胞培养 | 胰蛋白酶 | -- | -- |
| 转染 | Lipofectamine LTX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| siRNA敲低 | RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| Direct-zol RNA小提试剂盒 | Zymo Research | -- | |
| 逆转录 | SuperScript第一链合成系统 | Invitrogen | -- |
| qPCR | qPCRBIO SyGreen预混液 | PCR Biosystems | -- |
| qTOWER3热循环仪 | Jena Analytik | -- | |
| 测序 | TruSeq文库构建试剂盒 | Illumina | -- |
| NovaSeq6000测序平台 | Illumina | -- | |
| NextSeq测序平台 | Illumina | -- | |
| ChIPmentation | Tagment DNA试剂盒 | Illumina | -- |
| NEBNext高保真2X PCR预混液 | NEB | -- | |
| 质谱 | Q-Exactive质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 成像 | Leica DMI8显微镜 | Leica | -- |
| 超分辨成像 | Abberior STEDYCON超分辨显微镜 | Abberior | -- |
| 电子显微镜 | Zeiss EM900电子显微镜 | Zeiss | -- |
| 流式分选 | BD FACSAria II流式细胞分选仪 | BD | -- |
| 活细胞成像 | 自动活细胞成像系统 | Sartorius | -- |
| 药物处理 | RiboLock RNase抑制剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA酶处理 | RNase A | -- | -- |
| 染色质免疫沉淀 | Protein-A磁珠 | Invitrogen | -- |
| Protein-G磁珠 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白质印迹 | Amersham Protran 0.45 μm NC硝酸纤维素膜 | GE Healthcare | -- |
| 抗体 | 抗CTCF抗体 | Active Motif | 61311 |
| 抗SC-35抗体 | Novus Biologicals | NB100-1774 | |
| 抗HMGB1/2抗体 | Abcam | ab190377-1F3 | |
| 抗GFP抗体 | Abcam | ab290 | |
| 抗SRRM2抗体 | Thermo Fisher Scientific | PA5-59559 | |
| 荧光染料 | DAPI | -- | -- |
| 封片剂 | ProLong Gold防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| DNA示踪 | oligoFISH探针 | Genscript | -- |
| 基准珠（Tetraspeck 0.1µm珠） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 外切酶III | NEB | -- | |
| RNase H | NEB | -- | |
| 双琥珀酰亚胺PEG5交联剂 | Sigma-Aldrich | 803537 | |
| 溴脱氧尿苷 | Sigma-Aldrich | B5002 | |
| 溴脱氧胞苷 | Santa Cruz Biotechnology | sc-284555A | |
| APEX-seq | 生物素酪胺 | -- | -- |
| Dynabeads链霉亲和素C1磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SMART-Seq Total RNA Pico Input试剂盒 | TAKARA Bio | -- | |
| 分子动力学模拟 | EspressoMD模拟软件包 | -- | -- |
| RNA结合蛋白分析 | iCLIP裂解缓冲液 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和衰老诱导 | IMR90细胞系及其分离株（I-79、I-83），ICM浓度（10 μM）和处理时间（6天），DMSO对照，培养条件（MEM培养基、非必需氨基酸、10% FBS） 阅读提示：Methods: Cell culture |
| siRNA敲低 | siRNA序列和混合物组成，转染试剂（RNAiMAX），细胞密度和转染时间，敲低效率验证方法（RT-qPCR、Western blot） 阅读提示：Methods: SiRNA-mediated knockdown and Supplementary Table 2 |
| BANF1和SRRM2功能验证 | 过表达载体（piggybac系统），诱导剂（doxycycline）浓度和处理时间，SRRM2-RBD和IDR的氨基酸序列，对照（Venus空载体） 阅读提示：Methods: Overexpression; Figure 3 legend and Extended Data Fig. 3 |
| ChIPmentation和CUT&Tag | 抗体（抗SON、抗HMGB2、抗CTCF），交联条件（EGS和甲醛浓度、时间），MNase处理浓度和超声参数，测序平台和深度 阅读提示：Methods: ChIPmentation; Figure 4 legend and Extended Data Fig. 4 |
| Micro-C分析 | Micro-C数据处理参数（比对、去重、分辨率），环路和TAD calling方法，APA和insulation计算方式 阅读提示：Methods: Micro-C and Chrom3D modeling; Figure 5 legend |
| RNA-seq和剪接分析 | RNA-seq文库构建方法（TruSeq），测序平台（NovaSeq6000），生物重复数，剪接分析软件（Whippet）和参数（Δψ>0.3） 阅读提示：Methods: Splicing analysis; Figure 7 legend |
| LoopTrace实验 | 探针设计（oligoMiner），标记策略（BrdU/BrdC），杂交条件，成像平台（Nikon TI-E2），图像处理和分析软件（TraceBot, LoopTrace） 阅读提示：Methods: LoopTrace and data analysis; Figure 6 legend |