细胞培养与分化
建立人肝细胞体外模型。
将HepaRG细胞培养并进行28天分化，随后血清饥饿培养两天。
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33种不同全氟和多氟烷基物质（PFAS）在分化HepaRG细胞中诱导的转录组改变分析
Analysis of transcriptomic alterations induced by 33 different per- and polyfluoroalkyl substances (PFAS) in differentiated HepaRG cells
实验完整度
高包含体外细胞模型（HepaRG）的毒性评估（MTT）、全转录组测序（RNA-seq）及IPA通路分析，并进行功能验证，从多个层面（基因表达、通路、上游调控因子）验证机制，证据等级完整。
主要模型
分化的人肝细胞瘤HepaRG细胞 MTT细胞毒性实验模型
重点核对
不同PFAS处理浓度（低、中、高）及其对应的实际浓度（5-250 µM） 细胞培养条件：HepaRG细胞分化流程（28天分化及后续2天无血清培养） RNA-seq分析流程：包括文库制备（SMART-Seq）、测序平台（Illumina NovaSeq/NextSeq 550）和生物信息学处理（kallisto比对、DESeq2差异表达分析） DEGs筛选阈值：|log2FC| > 0.5 且 padj < 0.05 IPA分析参数：人类物种、肝脏组织及肝细胞系，仅直接关系
摘要
由于许多全氟和多氟烷基物质（PFAS）在人体中的高持久性和不良健康效应，其使用已受到限制。因此，新型PFAS越来越多地被引入工业应用，尽管这些化合物中许多的毒理学数据仍然有限或缺乏。本研究探讨了新型PFAS的分子作用机制，重点关注具有直链或支链结构以及羧酸或磺酸官能团的单醚和聚醚PFAS。分化的HepaRG细胞（一种人肝细胞模型）分别暴露于不同PFAS同系物的三个非细胞毒性浓度下24小时。提取总RNA并进行全转录组分析。该研究提供了总共33种PFAS同系物的转录组数据，其中13种为首次报道。对于大多数PFAS，差异表达基因（DEG）的数量呈浓度依赖性增加，而五种PFAS即使在最高测试浓度下也只诱导了微小的转录变化。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）显示所有33种PFAS的转录反应大致相似，表明尽管PFAS同系物之间存在显著的结构差异，但在HepaRG细胞中产生了趋同的分子效应。测试的PFAS持续激活与脂肪酸和脂质代谢相关的经典通路，主要受核受体PPARα调控，也影响与外源物代谢相关的通路，部分与PXR和CAR信号传导相关。此外，几种PFAS抑制了胆固醇和胆汁酸生物合成通路。IPA进一步预测了对肝细胞相关上游调节因子如HNF4A、HNF1A和FOXA2的影响。最后，IPA毒理学功能分析表明PFAS诱导的转录变化与胆汁淤积相关的肝脏疾病存在关联。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 研究旨在探究多种新型PFAS（包括单醚和聚醚PFAS）在人肝细胞中的分子作用机制，并比较其转录组反应。
- 核心机制
- 大多数PFAS通过激活核受体PPARα调控脂肪酸和脂质代谢，并通过PXR/CAR信号通路影响外源物代谢；部分PFAS抑制胆固醇和胆汁酸生物合成，可能与CYP7A1下调有关。
- 主要证据
- 利用分化HepaRG细胞暴露于33种PFAS后进行RNA-seq，发现29种PFAS激活PPARα下游基因；IPA预测PPARα为关键上游调控因子，并观察到胆固醇合成基因及CYP7A1的表达抑制。
- 研究意义
- 研究首次提供了13种PFECA/PFESA同系物的转录组数据，证实了PFAS共享肝毒性机制，并为流行病学中PFAS暴露与血清胆固醇的关联提供机制学解释。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
PFAS暴露
评估不同浓度的PFAS对HepaRG细胞转录组的影响。
在第30天，用33种PFAS各自三个非细胞毒性浓度处理细胞24小时。
细胞活力评价（MTT）
确定各PFAS的细胞毒性，以选择非细胞毒性浓度。
利用MTT法检测细胞活力，比较处理组与溶剂对照组。
RNA提取与质量评估
获取高质量RNA用于转录组分析。
使用RNeasy Mini Kit提取总RNA，通过Qubit和Fragment Analyzer评估质量和完整性。
RNA测序及数据分析
鉴定差异表达基因（DEGs）并进行通路分析。
构建cDNA文库，在Illumina平台上测序，进行生物信息学分析，包括比对、过滤、批次效应移除和DEG分析，随后进行IPA通路分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | William's E培养基 | PAN Biotech | P04-29150 |
| 胎牛血清 | PAN Biotech | P40-47100 | |
| 胰岛素 | PAN Biotech | -- | |
| 氢化可的松琥珀酸酯 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素和链霉素 | Capricorn Scientific | -- | |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒100x溶液 | Capricorn Scientific | -- | |
| 人肝细胞生长因子 | Thermo Fisher Scientific | 100-39H | |
| 人表皮生长因子 | Thermo Fisher Scientific | AF-100-15 | |
| 牛血清白蛋白 | Carl Roth | CP84 | |
| 细胞毒性检测 | MTT试剂 | -- | -- |
| 曲拉通X-100 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy小提试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| 文库制备 | SMART-Seq mRNA LP试剂盒 | Takara Bio Inc. | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq测序仪 | Illumina | -- |
| NextSeq 550测序仪 | Illumina | -- | |
| RNA定量与质量评估 | Qubit 4.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 片段分析仪 | Agilent Technologies | -- | |
| RNA检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高灵敏度RNA分析试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 文库制备 | NucleoMag NGS纯化与大小筛选磁珠 | Takara Bio Inc. | -- |
| DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 高灵敏度小片段分析试剂盒 | Agilent Technologies | -- | |
| 文库定量 | KAPA文库定量试剂盒 | Roche Diagnostics | -- |
| 细胞毒性检测 | Infinite M Flex酶标仪 | Tecan | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养和分化 | HepaRG细胞传代数、分化天数（28天）、DMSO添加时间及浓度、无血清培养条件（如HGF和EGF浓度） 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell culture 部分 |
| PFAS暴露 | 各PFAS的溶液浓度、溶剂（异丙醇或DMSO）、处理时间（24小时）、细胞接种密度 阅读提示：Materials and methods 中的 Chemicals 和 Cell culture 部分 |
| MTT细胞毒性实验 | 细胞接种密度（9000个/孔）、MTT浓度（0.05 mg/mL）、孵育时间（1小时）、测量波长（570nm）、阳性对照（0.01% Triton-X 100）、重复次数 阅读提示：Materials and methods 中的 Cytotoxicity 部分 |
| RNA-seq | RNA提取方法、文库制备试剂盒、测序平台和模式、RNA质量要求（RQN>7）、比对参考基因组、DEG筛选阈值（|log2FC|>0.5, padj<0.05） 阅读提示：Materials and methods 中的 RNA preparation, RNA library preparation and sequencing, Processing of RNAseq data 部分 |
| IPA分析 | 分析参数（阈值、物种、组织、细胞类型、关系类型）、比较分析的浓度分类 阅读提示：Materials and methods 中的 Ingenuity pathway analysis 部分 |