BeWo b30细胞培养与屏障完整性评估
确定细胞单层形成的最佳时间，确保屏障完整性适合转运实验。
BeWo b30细胞在Transwell插入系统中培养14天，每日测量TEER值，并在第3、6、9、12天进行NaF渗漏实验，第9天进行ZO-1免疫荧光染色。
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离体胎盘灌注与体外BeWo b30细胞模型评估发育和生殖毒性化合物转移的比较
Comparison of ex vivo placenta perfusion and in vitro BeWo b30 cell models for assessing transfer of developmental and reproductive toxic compounds
实验完整度
高包含体外BeWo b30细胞模型、离体人胎盘灌注两种独立证据层级，并进行了功能验证（屏障完整性、细胞活力）和机制相关比较（参数对比、水解校正）。
主要模型
BeWo b30细胞模型 离体人胎盘灌注模型
重点核对
BeWo b30细胞培养至第9天进行转运实验 化合物浓度：安替比林1 μg/mL、阿莫西林5 μg/mL、丙戊酸50 μg/mL、沙利度胺1 μg/mL（临床相关Cmax浓度） 胎盘灌注实验使用足月胎盘，封闭-封闭构型，持续3小时 BeWo b30实验中化合物以混合物和单独形式添加 校正沙利度胺自发水解（降解动力学R²：灌注系统0.93，插入系统0.99）
摘要
由于下一代风险评估（NGRA）采用暴露主导方法，预测暴露以进行风险评估的兴趣日益增加。在发育和生殖毒理学（DART）领域，胎盘转移数据对于估计胎儿暴露至关重要。然而，人类相关数据通常有限或不可用。离体人胎盘灌注被认为是胎盘转移研究的金标准，但其成功率低、组织可用性有限，且无法实现高通量数据收集。BeWo b30细胞可提供高通量、低层级替代方案，以收集人类相关的胎盘转移数据。本研究在两种模型系统中测试了沙利度胺、丙戊酸、阿莫西林和安替比林。推导了一个比较矩阵，以评估在两种系统中获得的每种化合物的共享胎盘转移参数值。在两种实验设置中计算了转移指数（TI）、相对转移速率、初始转移速率和表观渗透率（Papp）。BeWo b30细胞中的相对转移速率与胎盘灌注的TI高度可比，平均差异因子仅1.1。此外，对于初始转移速率和Papp值，我们发现胎盘灌注与BeWo b30实验之间的差异平均分别因子为4.5和2.4。要计算和从实验数据中提取哪个参数取决于潜在的科学问题，例如，是否需要定性/相对或定量/绝对的胎盘转移评估。然而，从两个系统得出的Papp值对于参数化生理基础动力学（PBK）模型和估计母体外部暴露后的胎儿暴露特别有用，尤其是在NGRA框架内。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 评估BeWo b30细胞模型作为离体人胎盘灌注的替代方法，用于预测发育和生殖毒性化合物的胎盘转移是否可行？
- 核心机制
- 两种模型系统均能反映化合物通过胎盘的被动扩散特性，转移指数与相对转移速率高度一致，支持BeWo b30作为低层级筛选工具的机制基础。
- 主要证据
- 比较了四种化合物（沙利度胺、丙戊酸、阿莫西林、安替比林）在两种模型中的TI、相对转移速率、初始转移速率和Papp值，发现相对转移速率与TI平均差异因子1.1，初始转移速率差异因子4.5，Papp差异因子2.4。
- 研究意义
- 研究表明BeWo b30模型可产生与金标准胎盘灌注相似的转移指数，适用于NGRA框架中的高通量筛选，定量Papp值有助于PBK模型参数化以估计胎儿暴露。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞活力检测
评估测试化合物在临床相关浓度下对BeWo b30细胞活力的影响，排除细胞毒性干扰。
BeWo b30细胞以1*10^4 cells/well接种于96孔板，暴露于四种化合物24小时，MTT法检测细胞活力，阳性对照为100 µM克唑替尼，阴性对照为培养基，溶剂对照为1% DMSO。
BeWo b30细胞转运实验
测定四种化合物在BeWo b30细胞单层中的转运参数。
在第9天，将化合物（单独或混合物）加入顶侧，在24小时内多个时间点从基底侧取样，并用LC-MS/MS分析浓度，计算Papp、相对转移速率和初始转移速率。
离体人胎盘灌注实验
测定四种化合物在人胎盘灌注模型中的转移参数，作为金标准对照。
足月胎盘（末次月经后第三孕期）取自知情同意产妇，封闭-封闭构型双面灌注3小时，定期取样测定母体侧和胎儿侧浓度，计算TI、Papp、初始转移速率和FM比。
化合物稳定性测试与沙利度胺水解校正
评估化合物在实验系统中的稳定性，并校正沙利度胺的自发水解。
将化合物混合物在三种条件下孵育：无绒毛叶的灌注系统、空胶原包被插入物、玻璃烧瓶，在相同时间点取样分析浓度，确定降解动力学并校正沙利度胺的转移数据。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证分子表达变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 无酚红DMEM/F12培养基 | Gibco | 21,041-025 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25,300-054 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | 15,140-122 | |
| 胎牛血清 | Serana | S-FBS-SA-015 | |
| 屏障完整性评估 | ZO-1单克隆抗体Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | 339,188 |
| 化合物处理 | 沙利度胺 | Scientific Laboratory Supplies | T144-1G |
| 缓冲液制备 | 磷酸二氢钾 | Merck | A387573 |
| 封闭剂 | 牛血清白蛋白V组分 | Roche Diagnostics GmbH | 10,735,086,001 |
| 缓冲液制备 | 乙酸 | Avantor Performance Materials | 6052 |
| 蔗糖 | VWR International | 27,480.294 | |
| 溶剂 | 二甲基亚砜 | Sigma Aldrich | D4540-100ML |
| 细胞活力检测 | MTT（噻唑蓝） | Sigma Aldrich | M5655-1G |
| 屏障完整性评估 | 荧光素钠盐 | Sigma Aldrich | 1,038,870,050 |
| 细胞培养包被 | 人IV型胶原 | Sigma Aldrich | C5533-5MG |
| 细胞培养 | 磷酸盐缓冲液 | Sigma Aldrich | -- |
| 化合物处理 | 丙戊酸 | Sigma Aldrich | PHR1061-1G |
| 阿莫西林三水合物 | Sigma Aldrich | 31,586-250MG | |
| 安替比林 | Sigma Aldrich | A5882-25G | |
| 缓冲液制备 | 氯化钠 | Sigma Aldrich | S9625-1KG |
| 七水硫酸镁 | Sigma Aldrich | 230,391-500G | |
| 碳酸氢钠 | Sigma Aldrich | 1.06329.1000 | |
| 二水氯化钙 | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| 葡萄糖 | Sigma Aldrich | G7021-1KG | |
| 免疫荧光染色 | Triton X-100 | Sigma Aldrich | 23,472-9 |
| DAPI | Sigma Aldrich | 32,670-5MG-F | |
| 胎盘灌注 | 人血清白蛋白 | Prothya Biosolutions | -- |
| 肝素 | LEO Pharma | -- | |
| 细胞培养 | T175聚苯乙烯细胞培养瓶 | Greiner Bio-One B.V. | -- |
| 细胞活力检测 | 96孔聚苯乙烯板 | Cellstar, Greiner Bio-One B.V. | -- |
| Biorad多功能酶标仪 | Bio-Rad | -- | |
| 转运实验 | PET插入膜（0.59 cm²表面积，0.4 µm孔径） | BRAND GMBH | -- |
| 24孔PET BRAND板 | BRAND GMBH | -- | |
| TEER测量 | 上皮伏欧表（Millicell ERS-2） | Millicell | -- |
| 可调电极探头组（MERSSTX03） | Millicell | -- | |
| 测试电极组（MERSSTX04） | Millicell | -- | |
| NaF渗漏实验 | Victor X3多功能酶标仪 | Perkin Elmer | -- |
| 黑色聚苯乙烯96孔板 | VWR International B.V. | -- | |
| 免疫荧光成像 | 蔡司LSM900显微镜 | Zeiss | -- |
| 化合物分析 | 液相色谱-串联质谱 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism 10.4.1 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 化合物处理浓度：安替比林1 μg/mL，阿莫西林5 μg/mL，丙戊酸50 μg/mL，沙利度胺1 μg/mL；阳性对照：克唑替尼100 μM；溶剂对照：1% DMSO；孵育时间：24小时。 阅读提示：Materials and methods, Cell viability assay 部分 |
| BeWo b30转运实验 | 细胞接种密度：2×10^5 cells/mL；培养时间：9天；化合物浓度：与活力实验相同；测试方式：单独和混合物；取样时间点：24小时内多个时间点；Papp计算时间点：60分钟。 阅读提示：Materials and methods, Transwell experiments 和 Compound transfer studies across the BeWo b30 cell layer 部分 |
| 离体胎盘灌注 | 胎盘来源：足月胎盘，知情同意；灌注构型：封闭-封闭；灌注时间：3小时；化合物混合物加入母体侧；取样时间点：多个，每次3 mL；Papp计算时间点：20分钟；TI计算时间点：20分钟；表面积假设：11.8 m²/35绒毛叶。 阅读提示：Materials and methods, Ex vivo placenta perfusion studies 部分 |
| 屏障完整性评估 | TEER测量：每日测量14天；NaF渗漏实验：第3、6、9、12天；TEER稳定值：第9天约135 Ω*cm²；NaF转移率：第9天后稳定。 阅读提示：Materials and methods, TEER measurements 和 NaF leakage assay 部分 |
| 沙利度胺水解校正 | 稳定性测试条件：无绒毛叶灌注系统、空插入物、玻璃烧瓶；温度37°C；取样时间点与实验相同；降解动力学R²：灌注0.93，插入0.99。 阅读提示：Materials and methods, Compound stability and hydrolysis of thalidomide 部分 |