构建功能性Rec8-dam融合蛋白
验证dam甲基转移酶与Rec8融合后不影响Rec8的减数分裂功能
通过同源重组在REC8基因3'端插入dam序列，构建SK1背景的Rec8-dam菌株，并检测孢子形成率和孢子活力。
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利用邻近标记和长读长测序解码染色体组织
Decoding chromosome organization using proximity labeling and long-read sequencing
实验完整度
高包含体外实验（重组dam处理裸露DNA和分离核）、体内实验（酵母减数分裂时间过程）和组学数据分析（ChIP-seq比较、ln(CoC)分析），并进行了功能验证（孢子形成率）。
主要模型
芽殖酵母SK1菌株减数分裂细胞 Rec8-dam融合蛋白标记的cohesin轴 wpl1Δ突变体减数分裂细胞 rDNA重复序列阵列
重点核对
酿酒酵母SK1菌株背景 Rec8-dam融合蛋白的内源表达 减数分裂诱导时间点（3、4、5、6小时）及ndt80Δ阻断 甲基化检测阈值0.61 数据扰动分析（shuffled datasets）
摘要
基因组方法已经提供了关于DNA-蛋白质相互作用和染色体结构的详细见解。然而，常用的技术不保留基于连通性的信息，导致大规模基因组组织仍未被很好表征。在这里，我们开发了npDamID，一种体内邻近标记技术，可不可逆地标记并随后解码蛋白质相关位点。npDamID将dam甲基转移酶拴系到目标蛋白上，然后通过纳米孔测序鉴定>100 kb读段上的甲基化碱基。作为概念验证，我们在芽殖酵母中分析了保守的基于cohesin的减数分裂骨架，该骨架将染色质组织成环状阵列。我们的数据重现了已知cohesin关联模式的显著特征，并且重要的是，揭示了细胞间的变异性。单读段分析揭示了相邻甲基化碱基之间距离依赖的短程和长程相关性。最后，我们方法的一个重要优势是能够在重复区域中定义蛋白质关联模式。通过将超长读段锚定到独特区域，我们定义了核糖体DNA位点内cohesin的体内关联模式。我们多才多艺的技术通过提供染色体因子异质关联模式的累积记录以及单条染色体的体内构象，有望阐明多样的染色体过程。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在单分子水平上保留连通性信息，解码蛋白质关联模式并揭示染色体组织结构？
- 核心机制
- npDamID通过将dam甲基转移酶拴系到目标蛋白，在体内标记邻近GATC位点，利用纳米孔测序检测甲基化，从而记录蛋白质关联的累积历史。分析单分子甲基化模式揭示了cohesin在DNA上的动态行为，如环挤压或滑动。
- 主要证据
- Rec8-dam在酵母减数分裂中产生时空积累的甲基化，与ChIP-seq数据高度相关；单读段分析显示长程正相关（ln(CoC)>0）和~165 bp周期性；wpl1缺失降低长程相关性；在rDNA重复序列中通过超长读段锚定揭示了cohesin关联模式。
- 研究意义
- npDamID提供了一种保留连通性信息的方法，能够分析单分子水平上的蛋白-DNA关联，包括重复序列区域，并揭示细胞间的异质性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导同步减数分裂并收集样本
在减数分裂过程中获得不同时间点的细胞群体，用于分析Rec8的时序结合
将酵母细胞在YPAG、YPAD、BYTA培养基中生长，然后转移到SPO培养基诱导减数分裂，在3、4、5、6小时收集细胞。
提取高分子量基因组DNA并进行纳米孔测序
获得超长测序读段以保留染色体的连通性信息
使用酶解细胞壁、裂解、酚氯仿抽提等方法提取高分子量DNA，使用Oxford Nanopore试剂盒和MinION测序仪进行测序。
甲基化调用与阈值确定
从纳米孔测序数据中识别GATC位点的甲基化状态
使用Guppy进行碱基调用，Remora进行甲基化检测，使用E. coli甲基化/非甲基化菌株确定阈值。
分析聚集的甲基化分布模式
验证npDamID结果与已知Rec8 ChIP-seq模式的一致性及生物学意义
计算每个GATC位点的甲基化比例，绘制整个基因组的甲基化分布图，检测着丝粒富集和时间积累，并与ChIP-seq数据比较。
进行单读段相关性分析
揭示同一DNA分子上不同位点甲基化的协调性
计算ln(CoC)作为两个GATC位点甲基化状态相关系数，分析不同距离下的相关性；进行甲基化span分析，并与shuffled数据比较。
验证wpl1缺失对cohesin动态的影响
测试cohesin卸载因子Wpl1对Rec8关联模式和动态的影响
构建wpl1Δ rec8-dam菌株，进行相同实验并比较甲基化模式、ln(CoC)和span分析。
分析rDNA重复序列区域的cohesin关联
利用超长读段定义重复序列区域的蛋白质关联模式
将包含20个rDNA重复序列的参考基因组用于比对，分析rDNA区域内的甲基化分布和ln(CoC)。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
提取高分子量DNA
纳米孔测序
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株构建 | SK1菌株背景，基因型Rec8-dam和wpl1Δ rec8-dam，以及对照菌株 阅读提示：Materials and methods: Yeast strains |
| 减数分裂诱导 | 培养基配方（YPAG, YPAD, BYTA, SPO）、细胞浓度1.85 OD、诱导温度30°C、时间点3-6小时 阅读提示：Materials and methods: Yeast cells preparation |
| DNA提取 | 细胞数量1×10^9，酶解时间40分钟，酚氯仿抽提步骤 阅读提示：Materials and methods: High molecular weight DNA extraction |
| 纳米孔测序 | 试剂盒种类（RAD004/LSK109/RBK004）、测序仪类型、flow cell型号 阅读提示：Materials and methods: Nanopore library preparation and sequencing |
| 甲基化调用 | 碱基调用软件Guppy，甲基化调用软件Remora，阈值0.61 阅读提示：Materials and methods: Base-calling and methylation calling |
| 数据分析 | shuffled data生成方法，ln(CoC)计算方式，span分析参数（读段>10kb，甲基化GATC占比>4.8%） 阅读提示：Materials and methods: Generating shuffled datasets, ln(CoC) analysis, Methylation span analysis |
| 体外对照实验 | dam浓度、SAM浓度、孵育时间1小时、温度37°C 阅读提示：Materials and methods: dam methylation of naked DNA, dam methylation of nuclei |