Differences in pre-surgical baseline tear proteome are associated with persistent post-refractive surgery pain
包含前瞻性临床队列收集泪液样本并进行TMT蛋白质组学分析及多蛋白统计建模，但缺乏功能验证或机制验证实验，主要集中于生物标志物发现。
泪液样本（来自LASIK或PRK术后患者的术前泪液） 人队列（疼痛组和无痛组）
疼痛组NRS≥3，无痛组NRS≤1，排除术前疼痛（NRS≥2）和Schirmer ≤4mm的患者 TMT标记采用18-plex试剂，每个仪器运行包含2通道合并泪液作为内参，最多16通道用于患者样本 样本来自两个站点（Portland和Miami），进行年龄、性别、部位、手术类型、隐形眼镜佩戴、Schirmer值等人口统计学匹配 多蛋白模型采用LASSO和最佳子集逻辑回归，最终模型包含PGRC1、IBP3、PFD3和SPB9 蛋白质表达差异采用倍数变化、AUC和随机森林重要性阈值筛选，并通过协变量调整验证稳健性
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
筛选接受LASIK或PRK手术的患者，根据术后3个月疼痛报告区分疼痛组和无痛组，以比较术前泪液蛋白质组。
从两个临床站点（Portland和Miami）招募接受双眼LASIK或PRK的患者，排除有眼部手术史、活动性眼病（包括干眼）的患者。收集术前（手术前约1小时）和术后3个月的疼痛评分（NRS），并根据术后3个月NRS评分分为疼痛组（NRS≥3，n=31）和无痛组（NRS≤1，n=47）。同时排除术前有疼痛（基线NRS≥3）或NRS=2、基线Schirmer≤4mm的患者。
定量检测术前泪液中的蛋白质组，并比较疼痛组与无痛组之间的差异。
在手术前约1小时使用Schirmer试纸采集双眼泪液，样本置于无菌管中并冷冻保存。蛋白质提取后采用TMTpro 18-plex试剂标记，并使用Orbitrap Fusion质谱仪分析。每个仪器运行包含2个合并泪液通道作为内参以标准化样本间差异。
识别术前泪液中能区分疼痛组与无痛组的关键蛋白，并构建多蛋白模型用于预测疼痛。
采用三种方法（倍数变化、ROC曲线AUC、随机森林重要性）筛选候选蛋白，得到39种差异蛋白。进一步使用LASSO回归进行特征选择，得到15种蛋白。然后基于包括最高倍数变化蛋白PGRC1的最佳子集逻辑回归，评估不同蛋白组合的AUC，最终确定包含4种蛋白的最佳模型。
探索差异蛋白之间的功能关系，以了解潜在生物学通路。
使用STRING数据库对39种差异蛋白进行蛋白质-蛋白质相互作用网络分析和功能富集分析，发现35种蛋白存在相互作用，富集到细胞外结构和分泌功能等相关条目。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 泪液采集 | 诊断性Schirmer泪液试纸 | Sports World Vision | -- |
| 泪液采集辅助用药 | 盐酸丙美卡因滴眼液，0.5% | Alcon Laboratories | NDC 61314-016-01 |
| 盐酸丙美卡因滴眼液，0.5% | Bausch and Lomb | NDC 24208-730-06 | |
| 样本储存 | 2毫升聚丙烯管 | Thermo Fisher Scientific | cat # 346911 |
| 2毫升聚丙烯管 | Sarstedt, Inc. | cat # 72.694.006 | |
| 蛋白质提取 | Eppendorf 1.5毫升离心管 | Eppendorf | cat # 022431081 |
| 蛋白质消化 | S-Trap微型离心柱 | Protifi | cat # C02-micro |
| 肽段定量 | Pierce定量比色肽测定试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | cat # 23275 |
| TMT标记 | TMTpro 18-plex试剂 | Thermo Fisher Scientific | cat # A52047 |
| 质谱分析 | Orbitrap Fusion质谱仪 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者筛选与分组 | 疼痛组NRS≥3，无痛组NRS≤1；排除基线疼痛（NRS≥3）或NRS=2；排除基线Schirmer≤4mm；患者无眼部疾病（包括干眼）和既往眼部手术史。 阅读提示：Methods 2.1, 2.3 |
| 样本采集 | 泪液采集使用Schirmer试纸，放置5分钟；使用0.5%丙美卡因滴眼液麻醉30秒；样本储存于-80°C。 阅读提示：Methods 2.2 |
| 蛋白组学分析 | 蛋白质提取使用5% SDS/100 mM HEPES (pH 8)；S-Trap消化；肽段标记使用TMTpro 18-plex；质谱仪采用Orbitrap Fusion；每run包含2个合并参照通道。 阅读提示：Methods 2.4 |
| 数据分析与模型 | 差异蛋白筛选：FC≥±1.5，AUC>0.6，RF重要性；LASSO逻辑回归（留一交叉验证，1-SE规则）；最佳子集回归起始蛋白为PGRC1；最终模型包含PGRC1、IBP3、PFD3、SPB9。 阅读提示：Methods 2.5, Results 3.3 |
