母体高脂饮食诱导子代外周视网膜性别和发情周期特异性的胶质细胞失调

Maternal High-Fat Diet Induces Sex- and Estrous Cycle-Specific Glial Dysregulation in the Peripheral Offspring Retina

作者信息Gintare Urbonaite, Patricija Cepauskyte, Neda I Biliute, Guoda Laurinaviciute, Daiva Dabkeviciene, Solveiga Samulenaite, Urte Neniskyte
PMID42565656
发布时间2026-08-03
DOI10.1167/iovs.67.10.20

实验完整度

该研究包含体内动物模型(母体高脂饮食小鼠),结合免疫组化分析多种胶质细胞标志物,并进行了性别和发情周期分层的功能验证。

主要模型

C57BL/6J小鼠 Thy1::EGFP转基因小鼠 Cx3cr1::CreER转基因小鼠 Cx3cr1::tdTomato小鼠

重点核对

母体饮食类型(对照饮食10%脂肪 vs 高脂饮食60%脂肪) 子代性别(雄性/雌性) 雌性子代发情周期阶段(动情前期、动情期、动情后期、动情间期) 小胶质细胞标志物(Iba1、tdTomato、CD68、TSPO) Müller细胞标志物(GFAP)

摘要

母体高脂饮食(mHFD)诱导代谢紊乱,导致子代大脑的炎症反应。视网膜作为中枢神经系统的一部分,可能受到类似影响。本研究旨在确定mHFD如何影响子代视网膜中的小胶质细胞和Müller细胞活性,并评估这些影响如何依赖于性别和雌性发情周期。雌性C57Bl/6J小鼠从断奶到哺乳期分别喂食对照饮食(10%脂肪)或高脂饮食(60%脂肪)。子代断奶后喂食正常啮齿动物饮食。通过免疫组化标记视网膜神经节细胞、Müller胶质细胞以及吞噬和炎症标记物,评估视网膜结构和胶质细胞。观察到的雌性子代视网膜变化与发情周期阶段相关。mHFD诱导子代外周视网膜出现微妙的视网膜结构变化和性别特异的胶质细胞改变。雄性小鼠表现出小胶质细胞面积减少,伴随溶酶体/吞噬溶酶体标志物增加,而雌性则表现出相反的模式。在母体对照饮食下,小胶质细胞面积及其吞噬和代谢免疫反应性随雌性发情周期波动,而mHFD减弱了各阶段之间的差异。此外,mHFD降低了雌性中Müller胶质细胞的免疫反应性,提示胶质细胞通讯改变。我们的研究结果表明,mHFD对子代外周视网膜具有性别特异性影响,影响视网膜小胶质细胞对雌性生殖激素的响应。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
母体高脂饮食是否以及如何影响子代视网膜胶质细胞,这种影响是否依赖于性别和雌性发情周期?
核心机制
母体高脂饮食以性别和发情周期依赖的方式扰乱子代外周视网膜小胶质细胞和Müller细胞的活性,可能通过改变小胶质细胞对雌激素和孕激素信号的响应。
主要证据
使用免疫组化检测了Iba1、tdTomato、CD68、TSPO和GFAP标志物,发现mHFD导致雄性小胶质细胞面积减少但CD68面积增加,雌性小胶质细胞面积增加但CD68面积在某些阶段减少,且雌性Müller细胞GFAP面积和突起长度减少。
研究意义
该研究首次表明mHFD对子代视网膜胶质细胞功能具有长期、性别和激素依赖的影响,且主要发生在外周视网膜,先于明显的神经退行性变化,提示胶质细胞失调是视网膜应激的早期事件。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立母体高脂饮食小鼠模型

模拟母体高脂饮食环境,并验证其对母体代谢状态的影响

雌性C57Bl/6J小鼠从断奶开始喂食对照饮食或高脂饮食,持续10周,随后配对、怀孕和哺乳期继续相同饮食。通过体重测量、葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验评估母体代谢状态。

2

收集子代视网膜样本

获取子代视网膜组织以进行后续分析

在子代22周龄时,通过阴道涂片确定雌性子代发情周期阶段,然后处死动物,摘取眼球,固定、冷冻、切片。

3

视网膜免疫荧光染色

标记视网膜神经节细胞、Müller细胞、小胶质细胞及其活化标志物

视网膜切片用20%正常山羊血清和0.4% Triton X-100封闭,与一抗(抗Iba1、抗GFAP、抗RBPMS、抗CD68、抗TSPO、抗tdTomato)孵育,随后与荧光二抗孵育,并用DAPI染色。

4

视网膜厚度和神经节细胞计数

评估mHFD对子代视网膜结构和神经元数量的影响

使用共聚焦显微镜测量视网膜各层厚度,并统计RBPMS阳性神经节细胞数量。

5

小胶质细胞面积和活化标志物分析

评估mHFD对子代外周视网膜小胶质细胞形态和活化状态的影响

使用Iba1和tdTomato标记小胶质细胞,CD68标记吞噬溶酶体,TSPO标记线粒体,测量细胞面积和标志物面积。

6

Müller细胞分析

评估mHFD对Müller细胞活化状态和形态的影响

使用GFAP标记Müller细胞,测量总面积和突起长度。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
C1090-10 modAltromin International--
C1090-60Altromin International--
NFM18Mucedola Settimo Milanese--
Thy1::EGFP--JAX:007788
Cx3cr1::CreER--JAX:021160
RC::LSL-tdTomato--JAX:007905
结晶紫----
Cryomatrix包埋剂Epredia--
Cryotome FE & FSE冰冻切片机Epredia--
正常山羊血清----
Triton X-100----
DAPI----
Mowiol封片剂Sigma-Aldrich--
兔抗Iba1抗体FUJIFILM Wako Chemicals USA019-19741
小鼠抗RFP抗体Rockland Immunochemicals200-301-379
大鼠抗CD68抗体Thermo Fisher Scientific14-0681-82
兔抗PBR/TSPO抗体Abcamab109497
鸡抗GFAP抗体Abcamab4674
兔抗RBPMS抗体GeneTexGTX118619
山羊抗兔Alexa Fluor 594二抗Thermo Fisher ScientificA-11012
山羊抗小鼠Alexa Fluor 647二抗Thermo Fisher ScientificA-32733
ECLIPSE Ti-S显微镜Nikon Corporation--
TCS SP8共聚焦显微镜Leica Microsystems--
EVOS FL自动成像系统Thermo Fisher Scientific--
IX83宽场荧光显微镜Olympus--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
母体饮食处理
母体饮食类型(CD vs HFD)、饮食开始时间、持续时间
阅读提示:Methods: Animals
子代取材
子代周龄、发情周期阶段确定方法、取材时间
阅读提示:Methods: Animals, Retinal Sample Collection
免疫染色
一抗和二抗的类型、浓度、孵育时间
阅读提示:Methods: Immunostaining, Table
图像获取与分析
使用的显微镜类型、图像采集参数、图像处理方法(阈值、滤波)
阅读提示:Methods: Retinal Layer Thickness and Ganglion Cell Count Assessment, Microglia and Müller Cell Analysis
统计设计
样本量、统计模型(嵌套ANOVA)、事后检验
阅读提示:Methods: Statistical Analysis