ILC3分离和PCHi-C图谱构建
建立ILC3启动子相互作用的高分辨率图谱。
从人扁桃体分离ILC3，使用DpnII-based低输入PCHi-C协议生成启动子相互作用数据，并通过CHiCAGO和ABCC分析。
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高分辨率启动子相互作用分析揭示参与3型固有淋巴样细胞活化的基因在免疫疾病风险中的作用
High-resolution promoter interaction analysis implicates genes involved in activation of type 3 innate lymphoid cells in immune disease risk
实验完整度
高包含PCHi-C、RNA-seq、CRISPRa/i、ELISA等多层级实验，并进行功能验证和机制探讨。
主要模型
原代人扁桃体来源ILC3 原代CD4+ T细胞 小鼠MNK-3细胞系
重点核对
ILC3和CD4+ T细胞的PCHi-C数据质量及相互作用检测（CHiCAGO score≥5） ABCC模型预测的增强子-启动子相互作用的验证（使用CRISPRi-FlowFISH数据） CLN3在MNK-3细胞中的表达水平（CRISPRa和CRISPRi效果） 细胞因子分泌实验中的刺激条件（IL-1β和IL-23浓度） mRNA电穿孔效率及蛋白表达验证
摘要
固有淋巴样细胞（ILC）是稀有的组织驻留淋巴细胞，在功能上类似于CD4+ T辅助细胞谱系的细胞，但缺乏抗原受体。3型ILC（ILC3）在屏障部位富集，调节炎症并促进组织完整性。在这里，我们使用低输入、高分辨率靶向染色体构象捕获技术，描绘了原代人ILC3的启动子锚定染色体接触，并将其与CD4+ T细胞中的进行比较。我们利用这些数据将克罗恩病全基因组关联研究变异与靶基因联系起来，涉及已知和未预料到的候选基因，包括CLN3，一种巴顿病的致病基因。我们证明，在小鼠ILC3样细胞系中过度表达Cln3会改变刺激诱导的转录程序和细胞因子分泌。将我们的方法扩展到另外五个免疫全基因组关联研究性状，揭示了ILC3活化调节因子的富集。我们的工作开发了方法，绘制了ILC3中的长程基因调控图谱，并优先考虑了在这一临床相关的免疫细胞类型中具有作用的免疫疾病风险基因。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ILC3中的启动子锚定染色体相互作用如何有助于理解免疫疾病风险基因？
- 核心机制
- CLN3下调是ILC3炎症反应的一部分，其过度表达通过改变刺激诱导的转录程序和细胞因子分泌来调节炎症输出。
- 主要证据
- 使用低输入PCHi-C在ILC3和CD4+ T细胞中鉴定启动子相互作用，结合GWAS优先排序和功能验证（CRISPRa/i和细胞因子ELISA）。
- 研究意义
- 本研究提供了改进的方法，并优先考虑了在ILC3中具有潜在作用的免疫疾病风险基因，为理解ILC3生物学和疾病贡献提供了基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较ILC3和CD4+ T细胞的启动子相互作用
鉴定ILC3和CD4+ T细胞共同的及特异的调控回路。
使用相同PCHi-C协议生成CD4+ T细胞数据，通过CHiCAGO和ABCC检测相互作用，并进行差异分析。
GWAS变异富集分析和基因优先级排序
将ILC3和CD4+ T细胞的调控元件与疾病风险变异联系起来，优先候选效应基因。
使用RELI和LDSC评估GWAS变异在PIRs中的富集，开发multiCOGS算法整合Fine-mapping和PCHi-C数据。
CLN3功能验证
验证CLN3在ILC3炎症功能中的作用。
在小鼠MNK-3细胞中使用CRISPRa和CRISPRi调控Cln3表达，进行RNA-seq分析转录变化，并通过ELISA检测细胞因子分泌。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 胎牛血清 | -- | -- |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 重组小鼠IL-2 | R&D Systems | -- | |
| 重组小鼠IL-7 | R&D Systems | -- | |
| 细胞刺激 | 重组小鼠IL-1β | R&D Systems | -- |
| 重组小鼠IL-23 | R&D Systems | -- | |
| CRISPRa/i | pLenti CMV rtTA3 Blast | Addgene | 26429 |
| TRE3G-dCas9-KRAB-P2A-mCherry慢病毒 | -- | -- | |
| dCas9-VP64融合基因 | Addgene | 61425 | |
| MS2-p65-HSF1反式激活复合物 | Addgene | 89308 | |
| lenti sgRNA(MS2)_puro优化载体 | Addgene | 73797 | |
| sgOpti | Addgene | 85681 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| psPAX2 | Addgene | 12260 | |
| Mirus TransIT-293T转染试剂 | Mirus | -- | |
| 细胞转染 | ATx电穿孔系统 | MaxCyte | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| cDNA合成 | Verso cDNA合成试剂盒 | -- | -- |
| ELISA | DuoSet ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| GloMax Discover酶标仪 | Promega | -- | |
| 免疫沉淀 | Myc-Trap琼脂糖珠 | ChromoTek | -- |
| 免疫印迹 | 抗Myc标签抗体 | Cell Signaling Technology | 2278 |
| 抗GFP抗体 | Invitrogen | A-11122 | |
| Revert 700总蛋白染色 | LI-COR | -- | |
| Odyssey DLx成像系统 | LI-COR | -- | |
| PCHi-C | DpnII限制性内切酶 | NEB | -- |
| Klenow片段 | NEB | -- | |
| 生物素-14-dATP | Jena Bioscience | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Life Technologies | -- | |
| MyOne C1链霉亲和素磁珠 | Life Technologies | -- | |
| AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- | |
| Agilent SureSelect系统 | Agilent | -- | |
| 测序 | HiSeq 2500测序仪 | Illumina | -- |
| 细胞分离 | EasySep人CD4+ T细胞富集试剂盒 | STEMCELL Technologies | 19052 |
| 胶原酶D | -- | -- | |
| DNase I | -- | -- | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | -- | |
| LIVE/DEAD Fixable Near-IR死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | -- | |
| 细胞分选 | FACSAria II流式细胞分选仪 | BD Biosciences | -- |
| 流式分析 | FACSymphony流式细胞仪 | BD Life Sciences | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PCHi-C | 细胞数量、固定条件、DpnII消化时间、连接条件、测序深度 阅读提示：Methods: Promoter capture Hi-C |
| CRISPRa/i | sgRNA序列、doxycycline浓度和诱导时间、细胞系构建 阅读提示：Methods: CRISPRa and CRISPRi |
| 细胞刺激 | IL-1β和IL-23浓度、刺激时间 阅读提示：Methods: Cell culture and mRNA electroporation |
| ELISA | 试剂盒型号、样本稀释、标准品 阅读提示：Methods: Enzyme-linked immunosorbent assay |