临床队列与长期生存随访
评估OV联合PD-1阻断在肢端黑色素瘤中的长期临床获益。
30例可切除肢端黑色素瘤患者接受Orienx010联合特瑞普利单抗新辅助治疗，随访5年，记录RFS、DMFS、EFS和OS。
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肢端黑色素瘤中新辅助溶瘤病毒联合PD-1阻断的长期生存获益：STING在耐药性及潜在治疗中的意义
Long-term survival benefit of neoadjuvant oncolytic virus plus PD-1 blockade in acral melanoma: implications of STING in resistance and potential therapy
实验完整度
高含临床试验、多组学分析及小鼠模型验证，具备体外与体内证据层级，并进行功能与机制验证。
主要模型
B16黑色素瘤小鼠足垫模型 肢端黑色素瘤患者队列
重点核对
患者入组标准为可切除的肢端黑色素瘤（30例） 按病理反应将患者分为应答者（≤50%残余存活肿瘤细胞）和无应答者（>50%） 治疗包括Orienx010（溶瘤病毒）联合Toripalimab（抗PD-1） STING激动剂KL340399的剂量：4 mg溶于1000 µL DMSO，稀释至0.4 mg/mL，每只鼠静脉注射50 µL（2 mg/mL） B16细胞接种剂量：5×10^5细胞/25 µL PBS，注射于小鼠足垫
摘要
背景 我们的Ib期新辅助试验显示，溶瘤病毒（OV）联合PD-1阻断在肢端黑色素瘤患者中实现了77.8%的病理学缓解率和81.5%的2年无复发生存率。在此，我们报告了延长至5年随访的持续临床疗效，并表征了耐药的分子决定因素，以指导生物标志物驱动的联合策略。方法 入组30例可切除的肢端黑色素瘤患者，并进行5年生存随访。采用整合的WES、WTS、TBS和Olink蛋白质组学分析治疗前和治疗后的肿瘤组织及匹配的血样。利用这些多组学特征描绘无应答者的耐药机制，并在小鼠黑色素瘤模型中验证，探索基于STING激动剂的联合治疗。结果 中位随访62.4个月时，5年无复发生存率和总生存率分别为70.7%（95% CI，53.7–93.0%）和80.0%（95% CI，66.9–95.7%）。整合的多组学分析显示，与应答者相比，无应答者未能实现肿瘤微环境的治疗性重塑。具体而言，无应答者的特征是与STING通路下调相关的基线先天免疫抑制；基线STING低表达与免疫浸润减少和临床结局较差显著相关。在小鼠黑色素瘤模型中，药理学激活STING通路恢复了先天免疫信号，并协同增强了OV联合PD-1方案的抗肿瘤疗效。结论 这些数据确立了新辅助OV联合PD-1阻断在肢端黑色素瘤中的持久长期临床获益。我们的研究结果确定STING功能障碍是治疗耐药的关键介质，为整合STING激动剂以优化该联合方案的临床疗效提供了依据。试验注册 回顾性注册：NCT04197882，2019-12-13。图形摘要补充信息 在线版本包含补充材料，可在10.1186/s40164-026-00786-0获取。关键词：黑色素瘤，新辅助治疗，溶瘤病毒，PD-1阻断，STING，生存
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 长期随访下，新辅助溶瘤病毒联合PD-1阻断在肢端黑色素瘤中的疗效如何，哪些分子机制决定治疗反应和耐药？
- 核心机制
- STING通路功能障碍导致先天免疫抑制和干扰素信号下调，从而介导对OV联合PD-1阻断的原发性耐药。
- 主要证据
- 基于30例患者5年随访的生存分析、多组学（WES、WTS、TBS、Olink）比较应答者与无应答者，以及B16小鼠模型中STING激动剂联合治疗增强抗肿瘤免疫的验证。
- 研究意义
- 本研究为肢端黑色素瘤的新辅助免疫治疗提供了长期疗效证据，并指出STING激动剂可作为生物标志物驱动的联合策略以克服耐药。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基线多组学分析
比较无应答者与应答者的基线基因组、表观基因组和转录组特征，以识别耐药相关的内在特征。
对30例治疗前活检样本进行WES、WTS和TBS分析，以及16例患者的Olink蛋白质组学，比较无应答者和应答者的突变、甲基化和基因表达。
治疗过程中的纵向多组学分析
揭示应答者和无应答者在治疗诱导的肿瘤微环境和系统免疫重塑中的差异。
分析治疗前后配对的肿瘤和血液样本，包括WES、WTS、TBS和Olink蛋白质组学，评估免疫浸润、基因表达和甲基化变化。
体内STING激动剂联合治疗验证
在免疫功能正常的小鼠模型中验证STING通路激活是否能增强OV联合PD-1阻断的抗肿瘤疗效。
使用B16黑色素瘤足垫模型，随机分组接受OV+抗PD-1或联合STING激动剂KL340399，监测肿瘤生长，并通过免疫组化和流式细胞术分析免疫微环境。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | KL340399（STING激动剂） | -- | -- |
| Orienx010（溶瘤病毒） | -- | -- | |
| 抗小鼠PD-1抗体 | InVivoMAb | BE0146 | |
| DNA提取与片段化 | Covaris S220超声破碎仪 | Covaris | S220 |
| DNA定量 | Qubit双链DNA高灵敏度检测试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| NanoDrop 2000分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | 2000 | |
| 测序文库构建 | DNBSEQ-T7RS测序平台 | BGI | DNBSEQ-T7RS |
| 靶向甲基化富集 | EZ DNA甲基化-闪电™试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 靶向甲基化捕获 | SeqCap Epi CpGiant 4 M panel | Roche | -- |
| RNA-seq | NuGEN Ribo-SPIA扩增技术 | NuGEN | -- |
| 免疫组化 | 抗p-STING抗体 | Affinity | AF7416 |
| 抗p-IRF3抗体 | HuaBio | HA722772 | |
| 抗p-TBK1抗体 | CST | 5483 | |
| 二抗检测试剂 | ZSGB-BIO | PV6001 | |
| AEC底物试剂盒 | ZSGB-BIO | ZLI-9036 | |
| 流式细胞术 | Zombie Aqua™可固定活力试剂盒 | BioLegend | 423101 |
| 细胞染色缓冲液 | BioLegend | 420201 | |
| BD LSRFortessa™ X-20流式细胞仪 | BD | LSRFortessa | |
| 细胞处理 | gentleMACS组织解离器 | Miltenyi Biotec | -- |
| 免疫组化 | 柠檬酸盐缓冲液 | Beyotime | P0081 |
| 山羊血清 | Beyotime | C0265 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者入组与分组 | 入组标准：可切除的肢端黑色素瘤；分组依据病理反应（≤50%残余存活肿瘤细胞为应答者，>50%为无应答者）；影像学进展患者归为无应答者 阅读提示：Methods - Tumor specimens and profiling |
| 治疗与剂量 | Orienx010用药剂量和方案；特瑞普利单抗剂量和给药时间；STING激动剂KL340399的剂量和给药途径（静脉注射50 µL，2 mg/mL） 阅读提示：Methods - Animal studies and drug formulation |
| 多组学分析 | WES、WTS、TBS的样本量、测序平台和参数；Olink蛋白质组学的时间点和分析方法 阅读提示：Methods - Tumor specimens and profiling, WES data processing, RNA-Seq data processing, DNA methylation profiling, Olink proteomics |
| 体内实验 | B16细胞接种剂量（5×10^5细胞/25 µL PBS）和部位；小鼠品系（C57BL/6J）；治疗分组和样本量（每组5只）；给药方案 阅读提示：Methods - Animal studies and drug formulation |
| 统计分析 | 统计方法：卡方检验、Fisher精确检验、Wilcoxon秩和检验、Kaplan-Meier分析、log-rank检验、Pearson相关、t检验 阅读提示：Methods - Statistics |