动物模型构建与样本收集
建立zQ175敲入小鼠模型，获取不同疾病阶段的纹状体和运动皮层组织。
使用B6J.zQ175 KI小鼠，杂合子，WT同窝对照，在6月龄和18月龄时微解剖纹状体和运动皮层。
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亨廷顿病全长度小鼠模型的时间分辨单细胞图谱定义了皮质纹状体功能障碍的阶段特异性特征
Temporal single-cell atlas of full-length Huntington's disease mouse model defines stage-specific signatures of corticostriatal dysfunction
实验完整度
高包含体外单核转录组、动物模型（zQ175和R6/2）以及人类HD数据集等多层级证据，并进行功能验证（如EM48免疫组化）和机制验证（如WGCNA和TF调控网络）。
主要模型
zQ175敲入小鼠（6月龄和18月龄，纹状体和运动皮层） R6/2小鼠模型（用于跨模型验证） 人类HD死后脑组织数据集（纹状体和皮层）
重点核对
小鼠品系：B6J.zQ175 KI，C57BL/6J背景，杂合子，年龄匹配的WT同窝对照 时间点：6月龄（早期症状）和18月龄（晚期症状） 脑区：微解剖的纹状体和运动皮层 样本量：每个时间点WT n=4，zQ175 n=4小鼠，共32个样本 CAG重复长度：zQ175约188个CAG重复，18月龄时CAG重复长度测定不确定
摘要
背景：亨廷顿病（HD）涉及进行性皮质纹状体功能障碍，但其时间动态和细胞类型特异性易感模式仍不完全了解。虽然最近在快速进展模型中的单细胞研究揭示了早期发育和区域变化，但在全长HTT模型中，区分致病机制与正常衰老的时间分析仍然缺乏。解决纹状体和皮质神经元群体在长时间内的阶段特异性时间动态对于识别细胞功能障碍的驱动因素至关重要。方法：从早期症状（6个月）和晚期症状（18个月）阶段的杂合zQ175敲入小鼠的纹状体和运动皮层生成了时间分辨的单核转录组图谱。这种全长亨廷顿蛋白模型能够对进行性回路功能障碍进行分期，并伴随生理性衰老。zQ175模型的高遗传CAG重复长度将细胞置于与转录失调和易感人类神经元群体身份侵蚀相关的体细胞扩增阈值之上，但在HD中最极端扩增所观察到的去抑制危机和细胞丢失之前，为进行性分子致病级联提供了可处理的窗口。对基因型依赖性效应进行建模，以区分细胞类型特异性的疾病机制与年龄相关和代偿性变化。将加权基因共表达和转录因子调控网络与蛋白质-蛋白质相互作用数据库整合，预测了阶段特异性程序的关键调控因子。研究结果在人类HD数据集和快速进展的R6/2小鼠模型中得到了验证。结果：时间基因和网络分析揭示了转录变化的发散、收敛和双相模式，将进行性疾病和神经元身份丧失与衰老区分开来。在人类HD和R6/2小鼠数据集中验证了21个细胞类型特异性基因共表达模块，揭示了细胞应激、蛋白质稳态和突触程序的阶段特异性变化。富含CAG重复长度依赖性基因的疾病模块解析了它们的时间进程。皮质和纹状体投射神经元的共同易感性涉及表观遗传调控因子Zswim6和剪接因子Rbfox1和Celf2在皮质纹状体功能障碍中的作用。整合网络分析确定了Foxo1、Neurod2和Npas2为阶段特异性转录调控因子。跨物种验证在人类HD中建立了保守的基因调控模块，建立了具有转化意义的可推广的细胞类型特异性基因模块。结论：这个时间分辨的图谱揭示了易感神经元群体中疾病相关基因表达程序和时间生理轨迹的阶段特异性转录动态，与单独衰老区分开来。这项工作为理解致病机制的时间和区域协调建立了重要框架，为阶段特异性治疗干预提供了分子见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在zQ175全长HTT小鼠模型中，皮质纹状体回路中细胞类型特异性的转录程序如何随时间进展，并与正常衰老区分开来？
- 核心机制
- 早期（6月龄）纹状体SPN出现应激反应调节因子（Foxo1）活性降低和身份基因侵蚀，晚期（18月龄）出现神经发育转录因子（Neurod2、Shox2、Bach1）的激活，导致发育程序去抑制；皮质IT神经元在18月龄出现BDNF-TrkB信号通路成分（Ntrk2、Homer1）下调。
- 主要证据
- 基于zQ175和WT小鼠的SPLiT-seq单核转录组，通过伪细胞混合效应模型和伪bulk分析鉴定差异表达基因，hdWGCNA识别共表达模块，TF调控网络分析预测调控因子，并在人类HD和R6/2数据集中验证模块保守性。
- 研究意义
- 该图谱为理解HD中时间和区域协调的致病机制提供了框架，并确定了阶段特异性干预的候选靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单核RNA测序文库制备与测序
获得细胞类型分辨的转录组数据以进行下游分析。
采用优化的SPLiT-seq（split-pool ligation-based barcoding）方法进行单核RNA测序，包括细胞核分离、固定、条形码逆转录、连接、文库扩增和Illumina测序。
单核RNA-seq数据处理与细胞类型注释
从原始测序数据生成基因表达矩阵，并对细胞类型进行注释和质量控制。
使用SPLiT-Seq_Demultiplexing管道处理原始FASTQ文件，使用STAR比对，FeatureCounts计数，UMI-tools折叠UMI。使用Seurat进行聚类，通过Azimuth和MapMyCells参考映射注释细胞类型，通过标记基因表达验证。
差异基因表达和时间模式分析
识别疾病相关的差异表达基因，并分类时间转录模式（发散、收敛、双相）。
使用伪细胞混合效应模型和伪bulk分析进行DGE分析，测试基因型效应、年龄效应和基因型-年龄交互作用。分类基因表达模式。
SPN身份丧失分析
量化zQ175 SPN中纹状体区室（基质/纹状体）和通路（D1/D2）身份的时间侵蚀。
对SPN进行亚聚类，使用Jensen-Shannon距离量化转录组身份丢失，分析区室和通路标记基因的失调。
加权基因共表达网络分析（hdWGCNA）
识别SPN和IT神经元中的疾病相关共表达模块及其时间动态。
使用hdWGCNA构建基因共表达网络，识别模块，计算模块特征基因，进行模块-性状相关性分析，并在人类HD和R6/2数据集中验证模块保守性。
转录因子调控网络分析
预测驱动阶段特异性转录变化的转录因子及其调控网络。
基于JASPAR2024基序扫描，使用XGBoost构建TF调控网络，计算调控子活性，进行差异调控子分析。
跨物种验证
验证从小鼠模型中识别的基因模块在人类HD和R6/2小鼠中的保守性。
将SPN模块与人类HD SPN（Lee等人）和R6/2（Lim等人）数据集进行模块保守性分析，并评估模块与CAG重复长度依赖性基因签名的相关性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组织化学 | 抗EM48抗体 | Millipore | MAB5374 |
| 山羊抗小鼠Alexa Fluor 546二抗 | -- | -- | |
| DAPI | -- | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| 显微镜成像 | Leica SP8共聚焦显微镜 | Leica | -- |
| 细胞核分离 | KIMBLE®全玻璃杜恩斯组织研磨器 | -- | -- |
| SUPERaseIN RNase抑制剂 | -- | -- | |
| RNaseOUT RNase抑制剂 | -- | -- | |
| 二硫苏糖醇 | -- | 3483-12-3 | |
| 40微米细胞筛网 | -- | -- | |
| Scienceware® Flowmi™细胞筛网 | -- | -- | |
| EVOS显微镜 | -- | -- | |
| Corning® CoolCell™冻存容器 | Corning | -- | |
| 细胞核固定 | 二甲基亚砜 | -- | 67-68-5 |
| SPLiT-seq文库制备 | Maxima H Minus逆转录酶 | -- | -- |
| T4 DNA连接酶 | -- | -- | |
| 蛋白酶K | -- | -- | |
| 链霉亲和素MyOne C1磁珠 | Thermo Fisher | -- | |
| KAPA HiFi 2X预混液 | KAPA | -- | |
| SPRI磁珠 | -- | -- | |
| Qubit荧光计 | Thermo Fisher | -- | |
| Agilent D5000 TapeStation | Agilent | -- | |
| KAPA HyperPlus试剂盒 | KAPA | -- | |
| DNA提取 | Qiagen Puregene细胞核心试剂盒 | Qiagen | -- |
| CAG重复长度分析 | 毛细管电泳 | -- | -- |
| TRACE | -- | -- | |
| 测序 | Illumina NovaSeq 6000 | Illumina | -- |
| S2 NovaSeq v1.5 6000流动槽 | Illumina | -- | |
| 200碱基对双端测序试剂盒 | Illumina | -- | |
| 数据分析 | R | -- | -- |
| Python | -- | -- | |
| Seurat | -- | -- | |
| Harmony | -- | -- | |
| UCell | -- | -- | |
| hdWGCNA | -- | -- | |
| fgsea | -- | -- | |
| edgeR | -- | -- | |
| limma | -- | -- | |
| scDlbFinder | -- | -- | |
| MAST | -- | -- | |
| GeneOverlap | -- | -- | |
| STRING | -- | -- | |
| XGBoost | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型 | 小鼠品系B6J.zQ175 KI，基因型（zQ175杂合子或WT），年龄（6或18月龄），性别，饲养环境（光照周期、温度、湿度），样本量（每组4只） 阅读提示：Methods - Animals |
| 组织解剖 | 脑区（纹状体、运动皮层），微解剖方法，组织重量（75-100 mg） 阅读提示：Methods - Single nuclei isolation and fixation |
| 单核分离 | 匀浆缓冲液组成，研磨次数，离心速度和时长，洗涤次数，核固定条件（1%甲醛10分钟），核储存缓冲液组成，冻存条件（5% DMSO，-80°C） 阅读提示：Methods - Single nuclei isolation and fixation |
| SPLiT-seq文库制备 | RT引物序列（poly(dT)15），RT循环参数，连接缓冲液组成，阻断寡核苷酸序列（BC_0126、BC_0066），UMI条形码序列，PCR循环数 阅读提示：Methods - SPLiT-seq sublibrary generation |
| 测序 | 测序平台（NovaSeq S2），测序读长（200 bp PE），测序深度（50-60K reads/核） 阅读提示：Methods - Illumina sequencing |
| 数据预处理 | 质控阈值（UMI≥500，线粒体%≤5%，UMI≤15000），双倍体检测率（7.5%），Harmony参数，UMAP参数 阅读提示：Methods - Single-nuclei RNA-seq quality control and clustering |
| 差异表达分析 | 伪细胞构建参数（每25或50核），模型公式（~Sublibrary+Sex+Condition），随机效应（replicate ID），对比定义，显著性阈值（adj. p<0.05，|log2FC|≥0.1） 阅读提示：Methods - Pseudocell differential gene expression analysis |
| hdWGCNA分析 | 软阈值参数（SPN=9，IT=6），网络类型（signed），minModuleSize=40，deepSplit，mergeCutHeight 阅读提示：Methods - hdWGCNA co-expression network analysis |
| TF调控网络分析 | 调控子定义参数（调控分数0.01，每TF最多200靶基因），XGBoost参数（max_depth=1等），差异调控子阈值（|log2FC|>0.1，adj. p<0.001） 阅读提示：Methods - Transcription regulatory network and regulon analysis |
| 免疫组织化学 | 抗体浓度（抗EM48 1:350），二抗浓度（未明），孵育时间，固定方法（4% PFA灌注） 阅读提示：Methods - EM48 immunohistochemistry |
| CAG重复长度分析 | PCR引物，毛细管电泳条件，18月龄CAG重复定长不确定 阅读提示：Methods - HTT CAG repeat sizing |