FEN1蛋白表达与纯化
获得用于RNA切割的FEN1蛋白。
构建pET28a-His-FEN1质粒，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，Ni-NTA纯化，SDS-PAGE验证。
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针对SARS-CoV-2感染的多重RNA疗法鼻内滴剂：黄芩素增强FEN1核酸酶切割作为病毒克星
Intranasal drop of multiplex RNA therapy for SARS-CoV-2 infections: baicalein-enhanced FEN1 nuclease cleaving as a virus buster
实验完整度
高体外实验（细胞系验证敲低效率、细胞毒性、RNA-seq）、体外核酸切割实验、体内实验（小鼠鼻内给药、SARS-CoV-2感染模型）及组织学、血液生化分析。
主要模型
HEK293T细胞 HepG2细胞 A549细胞 LLC细胞 RAW264.7细胞 C57BL/6J小鼠 mRosa26-PGK-hACE2小鼠（SARS-CoV-2感染模型）
重点核对
FEN1蛋白与hpDNA形成复合物并敲低靶mRNA的效率（体外细胞转染） SCLMs@FEN1-hpDNAs鼻内给药在小鼠肺部的分布和Ctsl mRNA敲低效率（剂量25、40、60 mg/kg） 黄芩素对LPS诱导的RAW264.7细胞炎症因子和ROS水平的影响（1 μg/mL LPS，30 μM黄芩素） S@F联合黄芩素对SARS-CoV-2感染小鼠病毒载量的影响（鼻、气管、肺、脑；剂量和时间点） S@F联合黄芩素对脑组织中病毒RNA和趋化因子Cxcl10、Ccl2、Ccl5水平的影响
摘要
尽管SARS-CoV-2大流行的急性期已经消退，但病毒的持续存在和变异进化继续挑战现有的抗病毒策略。在此，我们研究了一种鼻内纳米药物制剂，包含瓣状内切酶1（FEN1）和一组发夹结构的DNA探针（hpDNAs），我们设计其同时靶向高度保守的核衣壳RNA和宿主来源的组织蛋白酶L mRNA。这种双靶向方法旨在干扰病毒基因完整性和宿主依赖性进入途径。用稳定的、经济的hpDNAs替代传统的siRNA/sgRNA可能提高基于核酸的抗病毒药物的实用性。此外，还考察了抗炎剂黄芩素的联合给药，以评估其改善纳米药物细胞生物分布的潜力。我们的便携式鼻内滴剂，一种与黄芩素联合给药的多种靶点治疗，在感染SARS-CoV-2的小鼠中引起病毒载量的部分降低，表明这种多靶点策略可能为进一步开发提供一种替代的抗病毒模式。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 探讨鼻内给药的FEN1-hpDNA纳米药物（S@F）联合黄芩素是否能够有效抑制SARS-CoV-2感染。
- 核心机制
- FEN1-hpDNA复合物通过碱基互补配对靶向SARS-CoV-2核衣壳RNA和宿主Ctsl mRNA，切割RNA，从而抑制病毒复制和宿主依赖性进入途径；黄芩素通过抗炎作用减少免疫细胞吞噬纳米药物，促进其进入上皮细胞。
- 主要证据
- 体外实验显示FEN1-hpDNA能有效敲低靶mRNA且毒性较低；体内实验显示S@F鼻内给药可降低肺组织中Ctsl表达，联合黄芩素可降低感染小鼠鼻、气管、肺和脑中的病毒RNA水平，其中肺中sgRNA-N降低77.3%，CoV-N蛋白降低85.6%。
- 研究意义
- 该策略提供了一种多靶点、便携式鼻内滴剂，可能作为对抗SARS-CoV-2的替代抗病毒模式，并有望扩展为泛冠状病毒平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外RNA切割实验
验证FEN1蛋白在hpDNA引导下对靶RNA的切割活性。
在体外混合FEN1蛋白、hpDNA和5'-FAM标记的ssRNA，孵育后进行变性PAGE分析。
细胞水平敲低效率验证
评估FEN1-hpDNA复合物在多种细胞系中对靶基因的敲低效率、特异性和细胞毒性。
在HEK293T、HepG2、A549、LLC细胞中转染FEN1蛋白和hpDNA复合物，检测靶mRNA水平、细胞活力、RNA-seq等。
SCLMs纳米颗粒的制备与表征
制备并表征负载FEN1蛋白和hpDNAs的SCLMs纳米颗粒。
合成SCLMs，通过化学修饰将FEN1-SH和hpDNAs-SH连接到SCLMs上，得到S@F，并表征其尺寸、电位、稳定性。
鼻内给药后生物分布分析
评估SCLMs经鼻内给药后在体内的分布情况。
给小鼠鼻内给予Cy5.5标记的SCLMs，在多个时间点检测主要器官的荧光信号，并分析肺组织中的分布。
Ctsl mRNA靶向hpDNA筛选及体内效果验证
筛选对Ctsl mRNA敲低效率最高的hpDNA，并验证S@F鼻内给药在体内对Ctsl的敲低效果。
在LLC细胞中筛选6个hp-Ctsl，选出hp-Ctsl-L2；制备S@F后以不同剂量鼻内给药于C57BL/6小鼠，检测肺组织中Ctsl mRNA和蛋白水平。
黄芩素抗炎作用及对S@F细胞摄取的影响
验证黄芩素的抗炎作用及是否减少免疫细胞对S@F的吞噬，促进其进入上皮细胞。
用LPS刺激RAW264.7细胞，加入黄芩素，检测炎症因子和ROS；随后加入Cy5.5-SCLMs，分析免疫细胞摄取；在LPS诱导的ALI小鼠模型中，给予黄芩素和Cy5.5-SCLMs，观察肺组织分布。
SARS-CoV-2感染模型中的抗病毒效果评估
评估S@F联合黄芩素对SARS-CoV-2感染小鼠的抗病毒效果。
使用mRosa26-PGK-hACE2小鼠鼻内感染SARS-CoV-2（WH-09），按分组给予S@F和/或黄芩素，检测鼻、气管、肺和脑的病毒RNA和蛋白水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Royacel | RYS-KF21 | |
| 蛋白质纯化 | pET28a-His载体 | -- | -- |
| Ni-NTA亲和层析 | -- | -- | |
| 体外RNA切割 | Amersham Imager 600成像仪 | GE Healthcare | -- |
| 免疫荧光 | 抗His标签一抗 | Abclonal | AE003 |
| Alexa FluorTM 488标记的山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗 | ThermoFisher | A11001 | |
| DAPI | -- | -- | |
| 奥林巴斯FV1000共聚焦显微镜 | Olympus | -- | |
| 细胞转染 | TransIntroTM EL转染试剂 | -- | -- |
| siRNA合成 | siRNA | Sangon Biotech | -- |
| CRISPR-RNP | T7高产RNA转录试剂盒 | Vazyme | TR101 |
| RNA快速浓缩纯化柱试剂盒 | Sangon | B518688 | |
| RspCas13d蛋白 | Addgene | Plasmid | |
| 实时荧光定量PCR | RNA-easy分离试剂 | Vazyme | R701-01/02 |
| HiScript III第一链cDNA合成试剂盒（+gDNA去除） | Vazyme | R312-01 | |
| ChamQ Blue Universal SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂 | -- | -- |
| SynergyTM HT多功能酶标仪 | Bio-Tek | -- | |
| 流式细胞术 | FACS Calibur流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 纳米颗粒合成 | Pluronic共聚物F108 | -- | -- |
| 正硅酸四乙酯 | -- | -- | |
| 纳米颗粒表征 | 透射电子显微镜 | JEOL | JEM-1400 |
| 动态光散射 | Anton Paar | Litesizer | |
| Philes G9-9 S紫外-可见分光光度计 | Philes | -- | |
| 奥林巴斯FV3000激光共聚焦扫描显微镜 | Olympus | -- | |
| 动物实验 | 三溴乙醇 | Nanjing Aibei Biotechnology | M2940 |
| 生物分布成像 | Vilber FUSION FX7成像系统 | Vilber | -- |
| 免疫组化 | Thermo CRYOSTAR NX50切片机 | Thermo | -- |
| 3D HISTECH PANNORAMIC扫描仪 | 3D HISTECH | -- | |
| 抗Ctsl抗体 | Servicebio | GB115577 | |
| 抗SARS-CoV-2核蛋白抗体 | Servicebio | GB122133 | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | GLPBIO | GK10014 | |
| 抗Ctsl抗体 | Proteintech | 27952-1-AP | |
| 抗微管蛋白抗体 | Proteintech | 11224-1-AP | |
| HRP标记二抗 | ABclonal | AS014 | |
| 血液分析 | 血液分析仪 | TEK8500H4-0502 | -- |
| 自动生化分析仪 | Chemray 240 | -- | |
| 药物制备 | 黄芩素粉末 | -- | -- |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Beyotime | S1732 |
| 活性氧检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | S0033S |
| 流式细胞术 | CD45-FITC抗体 | Elabscience | AB-F1136C |
| 组织荧光染色 | 抗EpCAM抗体 | Proteintech | 21050-1-AP |
| 抗CD45抗体 | Abcam | ab208022 | |
| 抗CD31抗体 | Abcam | ab281583 | |
| 二抗 | Abcam | ab205718 | |
| iFluor® 555荧光染料 | AAT Bioquest | 11065 | |
| 分子生物学 | BeyoMagTM FFPE组织RNA提取试剂盒 | Beyotime | R0085S |
| TransScript® II探针一步法qRT-PCR预混液 | TransGen Biotech | AQ321 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| FEN1蛋白表达与纯化 | pET28a-His-FEN1质粒构建，大肠杆菌BL21(DE3)转化，IPTG浓度0.1 mM，温度20°C，诱导时间16小时，Ni-NTA纯化步骤。 阅读提示：Materials and methods: Expression and purification of the FEN1 protein |
| 体外RNA切割实验 | 反应缓冲液组成（10mM MOPS, 7.5mM MgCl2, 0.05% Tween-20, 0.01% NP-40），hpDNA和ssRNA的量，37°C孵育2小时。 阅读提示：Materials and methods: Cleaving ssRNA in vitro |
| 细胞转染与敲低实验 | 细胞系（HEK293T, HepG2, A549, LLC），每孔细胞数，FEN1蛋白和hpDNA的量，转染试剂（TransIntroTM EL），转染时间（24-72小时）。 阅读提示：Materials and methods: FEN1-protein/hpDNAs complex assay |
| 纳米颗粒制备与表征 | SCLMs合成条件（F108量、HCl浓度、TEOS量、DEDMS量），修饰比例（FEN1-SH 400 pmol, hpDNAs-SH 3600 pmol, SCLMs 0.78 mg），反应时间，粒径和zeta电位。 阅读提示：Materials and methods: Synthesis of SCLMs and SCLMs@FEN1-hpDNAs; Characterizations of nanoparticles |
| 鼻内给药和生物分布 | 小鼠品系（C57BL/6J），Cy5.5-SCLMs剂量（40 mg/kg），时间点（2-168小时），器官采集，成像系统。 阅读提示：Materials and methods: Biodistribution of nanoparticles |
| Ctsl mRNA敲低体内验证 | 小鼠品系（C57BL/6J），S@F剂量（25, 40, 60 mg/kg），给药途径（鼻内），检测时间点（48小时），Ctsl mRNA和蛋白定量方法。 阅读提示：Results section: 'Screening of hpDNAs for Ctsl mRNA and in vivo characterization' |
| 黄芩素处理 | 细胞类型（RAW264.7），LPS浓度（1 μg/mL），黄芩素浓度（30 μM），处理时间（24小时），ROS检测试剂盒。 阅读提示：Materials and methods: Immune cell stimulation and baicalein treatment |
| SARS-CoV-2感染模型 | 小鼠品系（mRosa26-PGK-hACE2），病毒株（WH-09），感染剂量（1×10^5 TCID50），给药方案（S@F第1、3天，黄芩素每日），组织采集时间（第5天），病毒定量方法（sgRNA-N, IHC）。 阅读提示：Materials and methods: Virus infection and drug administration procedure; Absolute quantification of SARS-CoV-2 subgenomic RNA |