建立小胶质细胞特异性TDP-43敲除小鼠模型
研究小胶质细胞TDP-43功能缺失对大脑发育的影响
通过Cx3cr1-CreERT2与Tardbp-floxed小鼠杂交，并在P6和P8给予他莫昔芬诱导敲除，验证敲除效率。
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小鼠小胶质细胞TDP-43介导髓鞘 refinement 并抑制 Tyrobp 隐蔽外显子 Inclusion
Microglial TDP-43 mediates myelin refinement and represses Tyrobp cryptic exon inclusion in mice
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内动物模型、空间转录组学、蛋白质组学等至少两个独立验证层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
小鼠条件性敲除模型(Cx3cr1-CreERT2;Tardbpfl) 原代小胶质细胞培养 OPC-小胶质细胞共培养模型 BV2小胶质细胞系
重点核对
小胶质细胞TDP-43敲除时间和方式：P6和P8腹腔注射他莫昔芬（75 mg/kg）诱导。 髓鞘吞噬实验条件：pHrodo标记的髓鞘碎片，处理4小时。 TREM2-DAP12信号验证：TREM2激动剂抗体4D9（20 µg/ml）刺激5分钟。 行为学测试时间：4月龄小鼠，早期敲除（P6-P8）与晚期敲除（2月龄）对比。 Tyrobp隐蔽外显子检测：RT-PCR和RT-qPCR确认包含。
摘要
TDP-43蛋白病是肌萎缩侧索硬化症和额颞叶痴呆等神经退行性疾病的标志，在这些疾病中，已在神经元和胶质细胞中观察到TDP-43的异常定位。然而，TDP-43在小胶质细胞中的作用及其功能缺失的后果尚未被探索。结合磁共振成像、共聚焦和电子显微镜，我们发现了缺乏小胶质细胞TDP-43的小鼠早期出生后大脑的结构变化和髓鞘异常。空间转录组学进一步揭示了与少突胶质细胞功能障碍相关的富集干扰素响应特征。早期清除小胶质细胞TDP-43导致成年小鼠运动缺陷。机制上，敲除TDP-43损害了小胶质细胞吞噬和降解髓鞘的能力，还导致 Tyrobp mRNA 中隐蔽外显子的包含，产生截短的DAP12蛋白，从而引起TREM2信号传导缺陷。我们的发现揭示了TDP-43在小鼠中调节TREM2-DAP12轴的作用，强调了TDP-43控制小胶质细胞功能的一个先前未识别的机制。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 小胶质细胞中TDP-43的功能缺失是否以及如何影响大脑发育和功能？
- 核心机制
- TDP-43通过抑制Tyrobp隐蔽外显子的包含，维持DAP12蛋白的正常功能，从而调节TREM2-DAP12信号通路，进而影响小胶质细胞的髓鞘吞噬和降解能力。
- 主要证据
- 在条件性敲除小鼠中，TDP-43缺失导致髓鞘异常、OPCs/OLs比例失衡和小胶质细胞吞噬缺陷；空间转录组学显示干扰素反应特征；细胞和分子实验证明TDP-43缺失导致Tyrobp隐蔽外显子包含，产生截短DAP12，损害SYK磷酸化。
- 研究意义
- 揭示TDP-43通过调节TREM2-DAP12轴控制小胶质细胞功能的新机制，为理解神经退行性疾病的早期病理提供线索。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
评估小鼠脑结构及髓鞘异常
检测TDP-43敲除后大脑微结构和髓鞘变化
使用扩散磁共振成像（DTI）分析大脑微结构，结合MBP和NF200免疫染色及电子显微镜观察髓鞘形态。
测定小胶质细胞髓鞘吞噬能力
验证TDP-43敲除是否损害小胶质细胞吞噬和降解髓鞘
分离原代小胶质细胞，与pHrodo标记的髓鞘碎片共孵育，通过流式和显微镜定量吞噬及降解效率。
分析少突胶质细胞谱系变化
评估TDP-43敲除对OPCs和成熟OLs比例的影响
通过免疫染色检测OLIG2、CC1和PDGFRα标记物，并进行共培养实验和条件培养基处理。
空间转录组学分析
揭示TDP-43敲除后脑区的分子变化，特别是干扰素响应特征
使用10x Visium对脑切片进行空间转录组测序，分析差异表达基因及通路富集。
RNA-seq鉴定隐蔽外显子
发现TDP-43调控的小胶质细胞特异性隐蔽外显子
对分选的小胶质细胞进行bulk RNA-seq，并使用DEXSeq和MAJIQ分析差异剪接事件，验证Tyrobp隐蔽外显子包含。
验证TREM2-DAP12信号通路受损
证实TDP-43敲除导致DAP12功能异常，影响TREM2下游信号
在HEK293细胞中过表达TREM2和DAP12（含或不含隐蔽外显子），或分离原代小胶质细胞，用TREM2激动剂或髓鞘刺激，检测SYK磷酸化。
行为学测试
评估小胶质细胞TDP-43敲除对小鼠行为的影响
对4月龄小鼠进行开放场、高架十字迷宫、转棒、悬挂抓握等行为测试。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验 | 他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | T5648 |
| 细胞培养 | TrypLE Express酶溶液 | Thermo Fisher Scientific | 12-604-021 |
| DMEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 11995073 | |
| 胎牛血清 | Thermo Fisher Scientific | 10500064 | |
| 青霉素-链霉素 | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| 多聚赖氨酸 | Sigma-Aldrich | P7886 | |
| 药物处理 | 4-羟基他莫昔芬 | Sigma-Aldrich | H7904 |
| 髓鞘分离 | MACS神经组织解离试剂盒(P) | Miltenyi Biotec | 130-092-628 |
| 髓鞘去除磁珠II | Miltenyi Biotec | 130-096-731 | |
| LS分离柱 | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MACS分离器 | Miltenyi Biotec | 130-091-051 | |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 |
| 吞噬实验 | pHrodo绿色染料 | Thermo Fisher Scientific | P36012 |
| 细胞处理 | DAPI | Thermo Fisher Scientific | D1306 |
| 蛋白裂解 | RIPA裂解液 | Merck Millipore | 20-188 |
| 蛋白酶抑制剂 | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| 蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | A32961 | |
| Western blot | Mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad | 4561086 |
| Trans-Blot Turbo Midi NC转印膜 | Bio-Rad | 170-4159 | |
| REVERT总蛋白染色液 | LI-COR Biosciences | 926-11011 | |
| 免疫荧光 | Mowiol 4-88封片剂 | Sigma-Aldrich | 81381 |
| 免疫染色 | 苏丹黑 | Sigma-Aldrich | 199664 |
| 空间转录组学 | RNeasy FFPE试剂盒 | Qiagen | 73504 |
| RNA ScreenTape | Agilent | 5067-5576 | |
| 4150 TapeStation系统 | Agilent | -- | |
| Visium空间基因表达载玻片 | 10x Genomics | 2000233 | |
| Visium小鼠转录组探针试剂盒，小型 | 10x Genomics | PN-1000365 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent | 5067-5582 | |
| MRI | ProHance造影剂 | -- | -- |
| Fomblin | -- | -- | |
| 电镜 | 硫代卡巴肼 | Millipore Sigma | 223220 |
| Durcupan ACM树脂 | Millipore Sigma | 44610 | |
| ACLAR包埋膜 | Electron Microscopy Sciences | 50425 | |
| 细胞分离 | Percoll分离液 | Cytiva | 17544502 |
| 抗CD11b磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-097-142 | |
| 抗O4磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-096-670 | |
| PDGFRα磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-101-50 | |
| 细胞培养 | PDGF-AA | Sigma-Aldrich | P3076 |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Gibco | 100-18B | |
| 生物素 | Sigma-Aldrich | B4639 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| NeuroBrew21添加剂 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | |
| 三碘甲状腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T6397 | |
| 甲状腺素 | Sigma-Aldrich | T0397 | |
| RNA提取 | RNeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | AM9738 | |
| 逆转录 | iScript cDNA合成试剂盒 | Bio-Rad | 1708891 |
| PCR | Accustart II GelTrack PCR预混液 | Quantabio | 84228 |
| RT-qPCR | Sensifast Sybr Green lo-Rox试剂盒 | Bioline | BIO-94020 |
| 行为学 | 旋转装置 | Ugo Basile | -- |
| 转染 | PolyJet体外DNA转染试剂 | SignaGen Labs | SL100688 |
| pSYK检测 | AlphaLISA检测 | Perkin Elmer | ALSU-PSYK-A10K |
| 免疫荧光 | 抗HA抗体 | Genescript | A01244 |
| 抗TREM2抗体 | R&D Systems | AF1828 | |
| 抗Tyrobp抗体 | Abcam | ab283679 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | L3000001 |
| 立体定位注射 | PSVue染料 | Brunschwig | POL25685-1 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型构建 | 小鼠品系：Cx3cr1-CreERT2;Tardbpfl；他莫昔芬剂量：75 mg/kg，P6和P8腹腔注射 阅读提示：Methods-Animals |
| 小胶质细胞吞噬实验 | pHrodo标记髓鞘碎片浓度：15 μg/ml；孵育时间：4小时 阅读提示：Methods-In vitro myelin assays and Phagocytic assay |
| TREM2信号检测 | TREM2激动剂抗体4D9浓度：20 µg/ml；刺激时间：5分钟 阅读提示：Methods-TREM2 agonist treatment |
| 行为学测试 | 测试年龄：4月龄；敲除时间：早期（P6-P8）和晚期（2月龄） 阅读提示：Methods-Behavioral testing |
| Tyrobp隐蔽外显子检测 | 样本：急性分离的小胶质细胞；检测方法：RT-PCR和RT-qPCR 阅读提示：Methods-PCR-based detection of CEs and RT-qPCR |