通过表位导向方法高效发现激动性抗OX40纳米抗体以解决富集驱动的表位偏差

背景：不考慮富集驅動偏差（如表位免疫原性、PCR擴增偏差或蛋白表達效率）的常規抗體發現方法，可能導致稀有但功能相關的克隆代表性不足，需要進行勞動密集的體外篩選才能從大量優勢克隆中鑑定出激動性抗體。因此，迫切需要高效的激動性抗體篩選方法。OX40因其在增強T細胞活化和存活中的作用，是癌症免疫治療的一個有前景的靶點。然而，有效的抗OX40激動性抗體尚未開發出來。方法：我們開發了一種新的篩選策略，包括針對gp34結合和未結合的OX40表達細胞進行淘選來富集納米抗體克隆池、進行下一代測序、以及通過計算聚類和減法分析來識別識別配體-受體界面的克隆。代表性的納米抗體克隆進行了體外驗證，包括表位作圖、結合親和力測量和功能評估。此外，我們對選定的納米抗體進行了工程化改造以增強其體內療效。我們還進行了納米抗體-OX40複合物的結構分析。結果：我們的表位導向方法有效地鑑定出識別與優勢免疫原性區域不同的功能相關表位的納米抗體克隆。值得注意的是，克隆Nb479表現出強大的激動活性，通過廣泛的OX40結合相互作用，緊密模擬了天然配體gp34。Nb479的三聚化促進了強效的OX40活化，而無需交聯支架。Nb479三聚體與抗血清白蛋白納米抗體的結合在體內顯示出顯著改善的藥代動力學，並在CD19嵌合抗原受體T細胞治療的小鼠模型中增強了抗腫瘤活性。結論：本研究提出了一種創新的表位導向方法，通過有效規避富集驅動的表位偏差，極大地加速了功能強大的激動性納米抗體的發現。我們的方法和工程化的多價抗OX40納米抗體為推進癌症治療的免疫治療策略提供了一個強大的平台。