TIBI方法的建立和验证
建立定量评估肿瘤边界构型的方法并验证其可重复性
在1,100个肿瘤的4mm直径热点中量化组织成分，通过ROC分析确定对肿瘤特异性生存预后最显著的组织类型，定义TIBI为纤维基质和脂肪组织面积除以肿瘤上皮、纤维基质、脂肪组织和细胞外黏液总面积的比值。进行两轮观察者间一致性评估。
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结直肠癌中的肿瘤浸润边界指数（TIBI）：将浸润性形态与分子见解联系起来
Tumor Invasive Border Index (TIBI) in colorectal cancer: linking infiltrative morphology to molecular insights
实验完整度
高包含两项独立队列的病理形态学评估、TCGA分子相关性分析、免疫组化及多重免疫组化验证，以及体外细胞功能实验（基因沉默）等多层次验证。
主要模型
结直肠癌患者队列（cohort 1, n=1100；cohort 2, n=776） TCGA-COAD/READ队列（n=350） TCGA-STAD胃癌队列（n=415） SW837细胞系（CRC细胞系）
重点核对
TIBI评估：在直径4mm热点内计算（纤维基质+脂肪组织）/（肿瘤上皮+纤维基质+脂肪组织+细胞外黏液）的面积比 TIBI阈值：低<40%，中40-67%，高>67% SW837细胞培养：RPMI-1640+10% FBS 敲低实验：L1CAM siRNA（SR302635B和SR302635C）和DSG3 siRNA池（sc-43115）转染 体外侵袭实验：5×10^4细胞接种于Matrigel包被的Transwell小室，24小时固定染色
摘要
肿瘤边界构型影响结直肠癌（CRC）的预后，但其分子决定因素仍不清楚，现有评估标准面临可重复性挑战。我们引入了肿瘤浸润边界指数（TIBI），一种新颖且可重复的方法，量化了最深处浸润处热点区域内肿瘤基质和脂肪组织的比例。TIBI在两个CRC队列（n = 1,100和n = 776）中进行了评估，并与肿瘤和患者特征进行了分析。在癌症基因组图谱（TCGA）CRC队列（n = 350）中探索了浸润性生长模式的分子相关性，关键特征得到了独立验证。高TIBI表明浸润性边界，与晚期疾病、肿瘤出芽、淋巴血管侵犯以及以M1样巨噬细胞和粒细胞密度降低为特征的免疫微环境相关。高TIBI独立预测更高的CRC特异性死亡率，在多变量风险比中，队列1为1.52（95% CI 1.07–2.17），队列2为2.45（95% CI 1.37–4.37）。分子分析揭示了与错配修复功能正常、TP53和KRAS突变、MYC信号下调以及上皮间质转化上调的关联。L1CAM和DSG3是在浸润性肿瘤中高表达的基因之一。作为实验验证，我们确定了高表达L1CAM和DSG3的CRC细胞系，并证明沉默它们可减少体外侵袭。TIBI相关的基因特征也预测了TCGA胃癌队列中的浸润性生长和不良结局。这些发现强调了肿瘤边界构型的分子特征，并将TIBI确立为具有临床相关性的肿瘤生物标志物。© 2026 The Author(s). The Journal of Pathology published by John Wiley & Sons Ltd on behalf of The Pathological Society of Great Britain and Ireland.
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 肿瘤边界构型（膨胀性vs浸润性）在结直肠癌中的分子决定因素是什么，以及如何可重复地对其进行量化评估？
- 核心机制
- 高TIBI的浸润性肿瘤富集上皮间质转化（EMT）通路，L1CAM和DSG3促进癌细胞侵袭，且与TP53和KRAS突变、MYC信号下调及免疫微环境改变（M1巨噬细胞和粒细胞密度降低）相关。
- 主要证据
- 两个大型CRC队列（n=1100和776）中TIBI与预后独立相关；TCGA队列中分子关联（TP53/KRAS突变、EMT）；体外实验中沉默L1CAM或DSG3显著降低SW837细胞侵袭（减少75%）。
- 研究意义
- TIBI作为一种可重复的形态学指标，可能补充现有的高风险特征（如肿瘤出芽），用于结直肠癌的风险分层，并可能指导辅助治疗决策。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TIBI与临床病理特征的关联分析
评估TIBI分类与已知不良预后因素的关系
在两个独立的CRC队列（cohort 1: n=1,100；cohort 2: n=776）中，根据TIBI分类与TNM分期、淋巴血管侵犯、肿瘤出芽、MMR状态等进行比较分析。
TIBI与肿瘤免疫微环境关联分析
探究高TIBI肿瘤的免疫细胞浸润特征
在cohort 1中使用多重免疫组化结合数字病理分析，量化多种免疫细胞类型（包括CD3+ T细胞、B细胞、浆细胞、巨噬细胞亚型、粒细胞、肥大细胞）的密度，并比较不同TIBI分类。
TIBI预后价值评估
验证TIBI是否独立于肿瘤出芽及其他因素预测生存
使用Kaplan-Meier曲线和Cox比例风险回归模型分析TIBI与癌症特异性生存（CSS）和总生存（OS）的关系，并在多变量模型中调整其他预后因素。
TIBI相关分子特征分析（TCGA）
探索高TIBI肿瘤的遗传和转录组特征
在TCGA CRC队列中评估TIBI，分析高频突变、差异表达基因、通路富集，并通过GISTIC分析拷贝数变异，随后使用免疫组化验证关键蛋白表达。
体外功能验证L1CAM和DSG3对侵袭的作用
测试敲低L1CAM或DSG3是否影响结直肠癌细胞的侵袭能力
选择高表达L1CAM/DSG3的SW837细胞系，使用siRNA敲低L1CAM或DSG3，通过Western blot验证敲低效率，并通过Matrigel transwell实验检测细胞侵袭能力。
TIBI转录组特征（TIBI-t）的泛癌验证
验证TIBI相关基因表达特征是否在其他癌症中具有类似的预后意义
从TCGA CRC中差异表达基因构建TIBI-t评分，在TCGA泛癌数据中分析其分布，并在TCGA胃癌（STAD）中验证与形态学TIBI、分子特征及预后的关联。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
单细胞分析
结构变异分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 免疫组化 | Leica Bond RX/3平台 | Leica Biosystems | -- |
| BOND聚合酶精炼检测试剂盒 | Leica | DS9800 | |
| BOND表位修复液2 | Leica | AR9640 | |
| 免疫组化（TP53） | TP53抗体（DO-7） | Epredia | -- |
| 免疫组化（L1CAM） | L1CAM抗体（14.10） | BioLegend | -- |
| 免疫组化（DSG3） | DSG3抗体（EPR14101） | Abcam | -- |
| 免疫组化（MYC） | MYC抗体（EP121） | Cell Marque | -- |
| 免疫组化（KRT17） | KRT17抗体（E3） | Leica | -- |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| Opti-MEM培养基 | Thermo Fisher Scientific | 31985-047 | |
| 细胞培养转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 56532 |
| siRNA转染 | L1CAM人siRNA寡核苷酸双链体 | Origene | SR422542 |
| siL1CAM-1 | -- | SR302635B | |
| siL1CAM-2 | -- | SR302635C | |
| DSG3 siRNA池 | Santa Cruz Biotechnology | sc-43115 | |
| 细胞侵袭实验 | Matrigel包被的Transwell小室 | Corning | 354480 |
| 结晶紫 | -- | -- | |
| 细胞活力测定 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | -- |
| 光学基因组图谱 | Saphyr系统 | Bionano Genomics | -- |
| DLE-1标记化学试剂 | Bionano Genomics | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| TIBI评估 | 热点定位：4mm直径（5×视野），位于最深浸润处；TIBI计算公式：纤维基质+脂肪组织面积除以肿瘤上皮+纤维基质+脂肪组织+细胞外黏液总面积 阅读提示：Materials and methods: Assessment of tumor border configuration; File S2 |
| 患者队列 | 队列1：n=1100，队列2：n=776；排除标准：术前放疗或化疗，术后30天内死亡的患者；随访时间：队列1中位9.5年，队列2中位5.9年 阅读提示：Materials and methods: Study population |
| 免疫组化 | 抗体稀释度：TP53 1:200，L1CAM 1:50，DSG3 1:80，MYC 1:30，KRT17 1:20；抗原修复：BOND Epitope Retrieval Solution 2，100°C 30分钟 阅读提示：Materials and methods: Immunohistochemistry and immune cell analyses |
| 细胞培养与敲低 | SW837细胞培养基：RPMI-1640+10% FBS；siRNA转染试剂：Lipofectamine RNAiMAX；敲低效率验证：Western blot 阅读提示：Materials and methods: Cell culture |
| 体外侵袭实验 | 细胞数：5×10^4；侵袭时间：24小时；固定：4% PFA 10分钟；染色：0.5%结晶紫15分钟；定量：10%乙酸洗脱，595nm测定吸光度 阅读提示：Materials and methods: Cell culture; Figure legends: Figure 4 |
| 统计分析 | 统计显著性：双侧p<0.05；多变量Cox模型调整变量：性别、年龄、手术年份、肿瘤位置、TNM分期、分级、淋巴血管侵犯、MMR、BRAF；TIBI分为三组：低（<40%）、中（40-67%）、高（>67%） 阅读提示：Materials and methods: Statistical analyses; Table 2 |