患者招募与临床评估
收集不同诊断的干眼患者和健康对照的临床样本，并评估疾病的严重程度和症状。
纳入25名HC、12名ATD和12名SjD-KCS患者，进行干眼严重度评分、OSDI、SANDE、TBUT、Schirmer I试验、角膜和结膜染色、泪河高度测量等。
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探究干燥综合征及非干燥综合征相关干眼中的结膜免疫通路
Investigating conjunctival immune pathways in Sjögren and non-Sjögren disease associated dry eye
实验完整度
中包含患者样本的转录组分析（NanoString）及免疫荧光验证，但样本量有限，且缺乏体外或动物模型验证。
主要模型
患者结膜印迹细胞学样本（HC、ATD、SjD-KCS） 患者结膜组织（免疫荧光）
重点核对
样本采集部位：颞侧球结膜，使用EyePrim装置 RNA提取试剂盒：RNeasy Mini Kit（Qiagen） 基因表达分析平台：NanoString nCounter Human Immunology V2 panel 差异表达基因筛选阈值：fold change ≥1.2或≤-1.2，p-adj<0.05 正常对照组纳入标准：干眼严重度评分为0
摘要
目的：干眼病（DED）根据其主要病因分为水液缺乏型（ATD）、蒸发过强型或混合型。干燥综合征角结膜炎（SjD-KCS）是一种非常严重的自身免疫性ATD DED。本研究的目的是比较从ATD、SjD-KCS患者和健康对照（HC）结膜中采集的转录组变化，以评估基于诊断的眼表免疫反应差异。方法：使用EyePrim装置采集颞侧球结膜的印迹细胞学样本。提取RNA并使用Nanostring nCounter Human Immunology V2 panel进行基因表达分析。结果上传至ROSALIND和Metascape，通过比较（所有DED vs HC；SjD vs HC；ATD vs HC）识别差异表达基因（DEGs）及相关的预测通路。一部分样本（每组n=4）用于LAMP3和HLA-DR的免疫荧光染色。结果：研究共纳入49名患者（25名HC；12名SjD；12名ATD）。在所有DED与HC的比较中发现100个DEGs。SjD与HC比较中发现69个DEGs。ATD与HC比较中发现11个DEGs。SjD与ATD比较中没有发现DEGs。DEGs涉及与病毒反应、适应性免疫和细胞间通讯相关的免疫通路。与HC相比，DED结膜中LAMP3和HLA-DR表达增加。结论：我们的研究结果表明，无论诊断如何，DED眼表都具有相似的免疫相关DEGs和相关通路。关键词：干燥综合征，干眼，结膜，印迹细胞学，水液缺乏型干眼
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 比较ATD、SjD-KCS和健康对照结膜中的转录组变化，以评估基于诊断的眼表免疫反应差异。
- 核心机制
- 无论干眼诊断如何，眼表免疫反应共享相似的免疫相关DEGs和通路，涉及I型和II型干扰素信号、MHC I类和II类抗原呈递、吞噬和补体系统等。
- 主要证据
- NanoString分析显示所有DED vs HC有100个DEGs，SjD vs HC有69个，ATD vs HC有11个，但SjD vs ATD无显著DEGs；免疫荧光显示DED组LAMP3和HLA-DR表达增加。
- 研究意义
- 研究提示眼表可能具有炎症阈值，超过该阈值后免疫反应相似，与体征和症状严重程度无关。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
结膜印迹细胞学采样和RNA提取
获得结膜细胞用于基因表达分析。
使用EyePrim装置从颞侧球结膜采集印迹细胞学样本，RNA提取使用RNeasy Mini Kit，并进行RNA质量检测和纯化。
NanoString基因表达分析
定量分析结膜样本中免疫相关基因的表达。
使用NanoString nCounter Human Immunology V2 panel分析594个转录本，使用ROSALIND软件进行数据标准化、差异表达分析和通路富集分析。
生物信息学分析
识别差异表达基因涉及的生物学通路和转录因子。
使用Metascape进行功能注释和通路富集分析，包括DisGeNET和TRRUST数据库；使用GSEA比较ATD和SjD之间的通路差异。
临床相关性分析
验证DEGs与干眼症状和体征的相关性。
选择CD74、LAMP3和HLA-DRB3，使用Spearman相关分析其与OSDI、SANDE、角膜染色、结膜染色等指标的相关性。
免疫荧光染色验证蛋白表达
在蛋白水平验证LAMP3和HLA-DR在结膜样本中的表达。
对每组4个样本的结膜印迹样本进行免疫荧光染色，使用抗LAMP3和HLA-DR抗体，观察表达情况。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
临床相关性分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 结膜印迹细胞学采样 | EyePrim装置 | Opia Tech | -- |
| Supor 450膜 | -- | -- | |
| RNA提取 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA质量评估 | NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | -- |
| Agilent Bioanalyzer | Agilent | -- | |
| RNA纯化 | RNA Clean & Concentrator试剂盒 | Zymo Research | -- |
| 基因表达分析 | NanoString nCounter Human Immunology V2 panel | NanoString | -- |
| 数据质量控制 | 小提琴图 | -- | -- |
| 数据分析 | ROSALIND | ROSALIND, Inc. | -- |
| 通路分析 | Metascape | -- | -- |
| GSEA分析 | fgsea R包 | -- | -- |
| 统计分析 | GraphPad Prism | GraphPad Software | -- |
| 韦恩图绘制 | Venny | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | EMD Millipore Biopore膜 | EMD Millipore | -- |
| LAMP3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| HLA-DR抗体 | Thermo Fisher | -- | |
| AlexaFluor 555驴抗兔二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| FITC驴抗鼠二抗 | Jackson ImmunoResearch | -- | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | Cat#H1399 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | -- | |
| 图像采集 | Nikon A1 RMP共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 图像处理 | NIS Elements AR软件4.20版 | Nikon | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者招募与临床评估 | 患者性别（均为女性）、年龄、分组（HC、ATD、SjD-KCS）及各项临床指标（严重度评分、OSDI、SANDE、TBUT、Schirmer I、角膜和结膜染色、泪河高度）的评估标准 阅读提示：Methods 4.1 Patients |
| 结膜印迹细胞学采样和RNA提取 | 采样装置（EyePrim）、采样部位（颞侧球结膜）、RNA提取试剂盒（RNeasy Mini Kit）及纯化试剂盒（RNA Clean & Concentrator Kit） 阅读提示：Methods 4.2 Conjunctival impression cytology and RNA extraction |
| NanoString基因表达分析 | NanoString panel（Human Immunology V2）、归一化方法（几何均值）、差异表达阈值（fold change≥1.2或≤-1.2，p-adj<0.05） 阅读提示：Methods 4.3 NanoString® and data analysis using ROSALIND® |
| 生物信息学分析 | Metascape分析参数、GSEA软件（fgsea R包）及统计阈值（Benjamini-Hochberg调整p值<0.05） 阅读提示：Methods 4.4 Gene Set Enrichment Analysis, 4.5 Pathway analysis and functional annotation using metascape |
| 免疫荧光染色 | 样本采集膜（EMD Millipore Biopore）、固定条件（100%甲醇，-20℃，10分钟）、透化（0.1% TritonX）、封闭（20%驴血清）、一抗（LAMP3和HLA-DR）浓度、二抗（AlexaFluor 555和FITC）浓度、核染色（Hoechst 33342）浓度及孵育时间、封片剂（Fluoromount-G） 阅读提示：Methods 4.6 Immunofluorescence staining and confocal microscopy |