建立 AKPS 原位移植模型并验证 NK 细胞作用
建立模拟人类 CRC 的肿瘤模型，并验证 NK 细胞在控制肿瘤生长中的作用。
将 AKPS 类器官原位移植到小鼠直肠，通过抗 NK1.1 抗体清除 NK/ILC1 后观察肿瘤重量变化。
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IL-27 塑造结直肠癌中 NK 细胞的异质性和功能
IL-27 shapes NK cell heterogeneity and function in colorectal cancer
实验完整度
高包含单细胞转录组学、流式细胞术、体外共培养、体内抗体阻断、过继转移及人类样本验证等多层级证据，并进行功能与机制验证。
主要模型
AKPS 肿瘤类器官原位移植小鼠模型 AOM/DSS 诱导的结直肠癌小鼠模型 患者来源的结直肠癌类器官（PDO） 小鼠 NK 细胞（体外共培养）
重点核对
AKPS 类器官携带 Apc−/−、KrasG12D/+、Trp53R172H/− 和 Smad4−/− 突变 原位移植模型中，抗 IL-27 抗体（MM27.7B1）以 250 μg 腹腔注射，于肿瘤生长第 0、2、4、6 天给药 体外共培养中，NK 细胞与 AKPS 类器官按 1:200 比例共培养，并使用 1 μg 抗 IL-27p28 抗体进行阻断 NK 细胞效应功能检测：与 MC38 靶细胞共培养，效应-靶比分别为 40:1 和 80:1，持续 6 小时
摘要
背景：结直肠癌（CRC）是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其特征是免疫抑制性肿瘤微环境（TME）。虽然适应性免疫有助于肿瘤控制，但越来越多的证据强调了固有淋巴细胞，特别是自然杀伤（NK）细胞，在早期抗肿瘤监视中的作用。然而，肿瘤浸润的 NK 细胞常表现出成熟缺陷和效应功能受损，而在 CRC 中调节 NK 细胞分化和活性的信号仍不清楚。白介素-27（IL-27）已被证明是抗肿瘤免疫的调节因子，但其在肠道肿瘤中调节 NK 细胞反应的作用在很大程度上未被探索。方法：我们采用基因工程改造的结直肠肿瘤类器官 Apc−/−KrasG12D/+Trp53R172H/−Smad4−/−（AKPS）的原位移植模型，研究 CRC 进展过程中 NK 细胞的异质性、成熟和功能。使用单细胞 RNA 测序、流式细胞术、免疫荧光和功能实验分析肿瘤浸润的固有淋巴细胞。使用体外共培养系统和体内 IL-27 阻断来评估肿瘤来源的 IL-27 对 NK 细胞转录程序和效应活性的影响。结果：单细胞转录组分析揭示了肿瘤浸润 NK 细胞中显著的异质性，识别出具有不同成熟状态和功能能力的亚群。在固有淋巴细胞中，AKPS 肿瘤以 NK 细胞为主，这些 NK 细胞表现出激活受体减少和细胞毒性及细胞因子产生潜力下降。表型和过继转移分析表明，TME 有利于未成熟 CD27+ NK 细胞亚群的持续存在，而限制了分化 NK 细胞。机制上，肿瘤来源的 IL-27 成为维持 NK 细胞浸润和激活的关键调节因子；IL-27 阻断减少了 NK 细胞积累、干扰素-γ 产生和未成熟亚群频率。这些发现的临床相关性得到了对人类 CRC 单细胞数据集的分析支持，该分析显示肿瘤内 NK 细胞中 IL-27 信号升高，并且患者来源的类器官能够增强 NK 细胞毒性，而 IL-27 阻断可降低这种细胞毒性。结论：我们的研究确定 IL-27 是 CRC 中 NK 细胞分化和功能的关键调节因子，强调了其在肿瘤微环境中维持 NK 细胞介导的免疫监视中的作用。这些发现为 CRC 中的 NK 细胞功能障碍提供了机制见解，并提示 IL-27 信号作为恢复固有抗肿瘤免疫的有前景的治疗靶点。关键词：结直肠癌，自然杀伤细胞，细胞因子
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 结直肠癌中肿瘤微环境如何影响 NK 细胞的异质性、成熟和功能，以及肿瘤来源的 IL-27 是否在其中发挥关键作用？
- 核心机制
- 肿瘤来源的 IL-27 通过维持肿瘤内 NK 细胞的浸润、激活和效应功能（如 IFN-γ 产生和细胞毒性）来支持 NK 细胞介导的免疫监视，并促进未成熟 CD27+ NK 细胞亚群的持续存在。
- 主要证据
- 基于 AKPS 类器官原位移植小鼠模型，结合单细胞 RNA 测序、流式细胞术、体外共培养、IL-27 阻断和过继转移实验，以及人类 CRC 单细胞数据集和 PDO 共培养功能验证。
- 研究意义
- 作者提出 IL-27 信号是恢复 CRC 中 NK 细胞功能的新靶点，为联合 NK 细胞靶向和 IL-27 为基础的免疫治疗策略提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单细胞转录组分析肿瘤浸润 NK 细胞异质性
刻画肿瘤内 NK 细胞的亚群组成和转录特征，识别与成熟和功能相关的异质性。
对 FACS 分选的肿瘤浸润 CD45+NK1.1+NKp46+ 细胞进行 scRNA-seq，基于基因表达进行聚类和注释。
流式细胞术和功能实验验证 NK 细胞表型和功能
在蛋白水平验证 NK 细胞的成熟亚群分布和效应功能缺陷。
通过流式细胞术分析肿瘤和肠固有层中 NK 细胞的 CD27、CD11b、KLRG1 表达，并通过 CD107a 脱颗粒、细胞毒性实验和胞内细胞因子染色评估功能。
体内追踪和过继转移实验分析 NK 细胞成熟动态
探究 TME 对 NK 细胞成熟和亚群维持的影响。
通过抗 CD45-PE 血管内染色标记和过继转移 CD27+ 或 CD11b+ NK 细胞，分析其在肿瘤中的成熟表型变化。
体外共培养揭示肿瘤来源 IL-27 对 NK 细胞的作用
评估肿瘤来源的因子（特别是 IL-27）对 NK 细胞转录和功能的影响。
将脾 NK 细胞与 AKPS 类器官或空 Matrigel 共培养，进行 bulk RNA-seq 和 GSEA 分析，并用抗 IL-27 中和抗体验证功能。
体内 IL-27 阻断和基因沉默验证作用
在体内验证肿瘤来源 IL-27 对 NK 细胞功能的影响。
对荷瘤小鼠给予抗 IL-27 抗体阻断或使用 shRNA 沉默类器官 Il27 表达，分析肿瘤体积、NK 细胞频率和亚群变化。
人类 CRC 数据集和患者来源类器官验证临床相关性
评估 IL-27 信号在人类 CRC 中对 NK 细胞的作用。
分析公共 scRNA-seq 数据集中 IL-27 信号特征评分，并使用 CRC PDO 与健康供体 NK 细胞共培养，检测 NK 细胞细胞毒性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM 培养基 | Euroclone | ECB7501L |
| RPMI-1640 培养基 | Euroclone | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 基质胶 | -- | -- | |
| IntestiCult OGMH 基础培养基 | STEMCELL Technologies | -- | |
| 温和细胞解离试剂 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞分离 | 红细胞裂解液 | Sigma Aldrich | R7757 |
| NK 细胞分离 | 小鼠 NK 细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-115-818 |
| 人 NK 细胞磁珠分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | -- | |
| PBMC 分离 | 淋巴细胞分离液 | Nycomed | -- |
| 细胞刺激 | PMA/离子霉素细胞刺激混合物 | eBioscience | 00-4970-93 |
| 布雷菲德菌素 A | Sigma Aldrich | B7651 | |
| 细胞培养刺激 | 白介素-15 | PeproTech | 210-15 |
| 白介素-2 | PeproTech | 200-02 | |
| 细胞培养 | β-巯基乙醇 | -- | -- |
| 细胞染色 | Ghost 染料红 780 活力染料 | Tonc Biosciences | 13-0865-T100 |
| 抗体 | 抗 NK1.1 单克隆抗体 | Leinco Technologies | N268 |
| 小鼠 IgG2a 同型对照抗体 | Bio X Cell | BP0085 | |
| 抗 IL-27 抗体 | InvivoMab | BE0326 | |
| 抗 IL-27p28 抗体 | BD Biosciences | 568409 | |
| 抗人 IL-27 p28 抗体 | R&D System | AF2526 | |
| 流式检测 | CD107a 抗体 | -- | -- |
| 流式分析 | LSR Fortessa 流式细胞仪 | Becton Dickinson | -- |
| 细胞分选 | FACSAria III 流式细胞分选仪 | Becton Dickinson | -- |
| Western blot | 蛋白质印迹 | -- | -- |
| ELISA | 酶联免疫吸附测定 | -- | -- |
| 细胞染色 | 羧基荧光素琥珀酰亚胺酯 | -- | -- |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | -- | -- | |
| 鬼笔环肽 | -- | -- | |
| 数据分析 | FlowJo 软件 | Becton Dickinson | -- |
| Prism 软件 | GraphPad | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系：C57BL/6J（CD45.2 和 CD45.1），年龄 6-12 周，性别匹配 阅读提示：Methods: Animals |
| 类器官培养 | AKPS 类器官携带突变：Apc−/−, KrasG12D/+, Trp53R172H/−, Smad4−/−；培养条件：Matrigel 包埋，IntestiCult OGMH 培养基；PDO 来源于 IV 期 CRC 患者活检 阅读提示：Methods: Mouse colon organoids; Patient-derived organoids; Results: Figure 6 legend |
| 原位移植 | 移植方式：AKPS 类器官原位注射（直肠）或皮下注射；分析时间：移植后 7 天 阅读提示：Methods: Intrarectal and subcutaneous AKPS organoid transplantation; Results: Figure 1 legend |
| IL-27 阻断 | 抗 IL-27 抗体（MM27.7B1）剂量 250 μg/只，腹腔注射，于移植后第 0、2、4、6 天给予 阅读提示：Methods: Intrarectal and subcutaneous AKPS organoid transplantation; Results: Figure 5A |
| NK 细胞功能检测 | 脱颗粒检测：NK 与 YAC-1 1:1 共培养 4 小时；细胞毒性检测：NK 与 MC38 8:1 共培养 5 小时（体内）或 6 小时（体外）；IFN-γ 检测：PMA/离子霉素刺激 6 小时 阅读提示：Methods: NK cell isolation; Results: Figure 2, Figure 5 |
| 体外共培养 | NK 细胞与 AKPS 或 PDO 类器官按 1:200 比例共培养；IL-15 浓度：10 ng/mL（转录组）或 5 ng/mL（功能）；抗 IL-27p28 抗体 1 μg 阻断 阅读提示：Methods: Co-culture experiments and functional assays; Results: Figure 4 |