临床样本中circSPARC表达及预后意义分析
明确circSPARC在ESCC中的表达水平及其与临床病理特征和预后的相关性。
对三个独立队列共124例ESCC及癌旁组织采用RT-qPCR、组织芯片FISH和RT-PCR检测circSPARC、EPN2-L/EPN2-S表达，并分析其与临床分期、T分期、淋巴结转移、肿瘤大小及总生存期的关系。
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CircSPARC通过HNRNPC-EPN2剪接轴激活Wnt/β-catenin信号促进食管鳞状细胞癌
CircSPARC promotes esophageal squamous cell carcinoma through an HNRNPC-EPN2 splicing axis that activates Wnt/β-Catenin signaling
实验完整度
高包含体外细胞功能实验、体内异种移植及肺转移模型、临床样本分析、RNA pull-down、RIP、RNA-seq及剪接分析等多个独立证据层级，并进行功能验证和机制验证。
主要模型
KYSE30和KYSE150人食管鳞状细胞癌细胞系 BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型 裸鼠尾静脉肺转移模型 ESCC患者组织样本（124例，含3个队列）
重点核对
circSPARC表达水平：通过RT-qPCR和FISH在配对ESCC组织（队列1和2）中验证 circSPARC与HNRNPC的结合：RNA pull-down、RIP实验验证，需要确认HNRNPC RRM结构域和circSPARC UUUUU基序 EPN2剪接事件：RT-PCR和RNA-seq分析，需确认circSPARC和HNRNPC对EPN2外显子3跳跃的影响 FZD7蛋白水平及降解：Western blot和生物素化内化实验，需验证EPN2-L对FZD7内吞和溶酶体降解的促进作用 Wnt/β-catenin信号激活：检测活性β-catenin及其下游靶基因（c-Myc、cyclin D1、Axin2）的蛋白水平
摘要
背景：Wnt/β-catenin信号通路的持续激活是食管鳞状细胞癌（ESCC）进展的关键驱动因素。环状RNA（circRNA）已成为癌症中致癌信号的关键调节因子。然而，circRNA如何促进ESCC中Wnt/β-catenin信号的持续激活尚不清楚。方法：对自测序和公共circRNA数据集的综合分析显示circSPARC在ESCC中表达升高。通过体外和体内实验评估了circSPARC对细胞增殖、迁移和侵袭的功能影响。使用RNA pull-down、RNA免疫沉淀（RIP）、可变剪接分析、RNA反义纯化（RAP）和细胞表面蛋白生物素化来阐明circSPARC介导ESCC中异常Wnt/β-catenin激活的分子机制。结果：本研究确定了一个circRNA介导的可变剪接轴，该轴促进Wnt/β-catenin信号的激活和ESCC进展。CircSPARC与HNRNPC（一种参与RNA加工的异质性胞核核糖核蛋白）相互作用，抑制epsin 2（EPN2）的肿瘤抑制性长转录本，从而损害网格蛋白介导的内吞依赖性Wnt受体frizzled 7（FZD7）的降解。这种相互作用导致Wnt/β-catenin持续激活，从而促进ESCC进展。相反，EPN2长转录本的表达可恢复circSPARC沉默诱导的Wnt/β-catenin信号抑制，并在体外和体内抑制ESCC细胞恶性。临床上，ESCC组织中circSPARC表达升高与患者预后不良相关。结论：这些发现揭示了一个circSPARC-HNRNPC-EPN2轴，通过不依赖突变的机制驱动持续的Wnt/β-catenin激活。在circSPARC高表达的肿瘤中靶向该通路是一种有前景的治疗策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- circRNA如何通过调控RNA剪接促进食管鳞状细胞癌中Wnt/β-catenin信号的持续激活？
- 核心机制
- CircSPARC通过其多聚尿苷酸基序与HNRNPC的RRM结构域结合，将HNRNPC招募至EPN2前体mRNA，促进EPN2外显子3跳跃，抑制长亚型EPN2-L表达；EPN2-L的缺乏导致FZD7经网格蛋白介导的内吞和溶酶体降解受损，从而维持Wnt/β-catenin信号持续激活。
- 主要证据
- RNA-seq和RT-PCR显示circSPARC和HNRNPC调控EPN2剪接；RNA pull-down、RIP和RAP验证circSPARC与HNRNPC及EPN2前体mRNA的结合；Western blot显示circSPARC敲低降低FZD7、活性β-catenin及靶基因水平；生物素化实验证明EPN2-L促进FZD7内化；异种移植和肺转移模型证实其体内作用。
- 研究意义
- 该研究揭示了一种不依赖突变的Wnt/β-catenin激活机制，并提出circSPARC表达水平可作为生物标志物，指导对Wnt/β-catenin抑制剂治疗可能获益的患者亚群，为ESCC精准治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circSPARC对ESCC细胞恶性表型的体外功能验证
验证circSPARC对ESCC细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭的影响。
在KYSE30和KYSE150细胞中通过siRNA敲低或质粒过表达circSPARC，利用IncuCyte实时监测增殖、克隆形成实验、Transwell实验评估细胞迁移和侵袭能力。
circSPARC对体内肿瘤生长和转移的影响
验证circSPARC对ESCC体内成瘤和肺转移能力的影响。
建立circSPARC稳定敲低或过表达的KYSE30细胞系，皮下注射至裸鼠构建异种移植瘤模型，尾静脉注射构建肺转移模型，测量肿瘤体积、重量及肺转移灶数量。
circSPARC相互作用蛋白的鉴定与结合位点验证
鉴定circSPARC结合蛋白并验证其关键结合区域。
通过RNA pull-down结合质谱鉴定circSPARC相互作用蛋白，通过截短体实验和突变体实验验证HNRNPC与circSPARC的结合依赖性。
circSPARC对全局可变剪接的影响及下游靶基因鉴定
分析circSPARC敲低后ESCC细胞中可变剪接的变化，确定关键剪接靶点。
对circSPARC敲低的KYSE30细胞进行RNA-seq，使用rMATS分析差异剪接事件，筛选并验证EPN2外显子3跳跃。
circSPARC通过HNRNPC调节EPN2剪接的机制验证
阐明circSPARC如何通过与HNRNPC相互作用影响EPN2前体mRNA上的剪接调节。
通过RIP、RAP、RT-qPCR和RT-PCR验证HNRNPC与EPN2前体mRNA的结合，以及circSPARC对结合和剪接结果的影响。
EPN2剪接变体对ESCC恶性表型的功能影响
评估EPN2-L和EPN2-S对ESCC细胞和肿瘤生长的不同功能影响。
在KYSE30和KYSE150细胞中分别过表达EPN2-L或EPN2-S，通过RTCA、克隆形成、Transwell检测细胞功能，并在裸鼠皮下模型中验证EPN2-L对肿瘤生长的影响。
EPN2-L调控Wnt/β-catenin信号通路的机制解析
探讨EPN2-L通过促进FZD7内吞和降解抑制Wnt/β-catenin信号的分子机制。
通过质谱分析EPN2-L差异蛋白，KEGG富集；Western blot检测β-catenin活性及靶基因；Co-IP验证EPN2与FZD7结合；生物素化实验分析FZD7内化和膜定位；溶酶体抑制剂处理验证降解途径。
Wnt/β-catenin信号抑制对circSPARC驱动的肿瘤进展的影响
验证药理学抑制Wnt/β-catenin信号能否阻断circSPARC过表达诱导的ESCC进展。
建立circSPARC过表达的KYSE30异种移植瘤模型，并用XAV-939（tankyrase抑制剂）处理，评估肿瘤生长以及Ki-67、活性β-catenin和FZD7表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| DMEM培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | -- | |
| MycoBlue支原体检测试剂盒 | Vazyme | -- | |
| 构建质粒 | pLC5-ciR载体 | Geneseed Biotech | -- |
| pLKO.1载体 | -- | -- | |
| pcDNA3载体 | -- | -- | |
| pLVX载体 | -- | -- | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 慢病毒包装 | psPAX2包装质粒 | -- | -- |
| pMD2.G包膜质粒 | -- | -- | |
| 药物处理 | 嘌呤霉素 | Solarbio | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| qRT-PCR | GoScript™逆转录系统 | Promega | -- |
| SYBR Green PCR预混液 | Promega | -- | |
| RT-PCR | 2 × Hieff Robust PCR预混液 | Yeasen Biotechnology | -- |
| RNA稳定性 | RNase R | Geneseed Biotech | -- |
| 增殖检测 | IncuCyte活细胞分析系统 | Sartorius | -- |
| 细胞染色 | 结晶紫 | Solarbio | -- |
| 迁移和侵袭 | Transwell小室 | Corning | -- |
| 基质胶 | BD Biosciences | -- | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| 脱脂牛奶 | Solarbio | -- | |
| ECL底物 | NCM Biotech | -- | |
| 核质分离 | PARIS™试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| FISH | RNA FISH试剂盒 | Ribobio | -- |
| DAPI | -- | -- | |
| 成像 | 激光共聚焦显微镜 | Nikon A1R HD25 | -- |
| RNA pull-down | Pierce链霉亲和素磁珠 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 3'生物素标记circRNA探针 | GenePharma | -- | |
| RIP | Magna RIP™ RNA结合蛋白免疫沉淀试剂盒 | Sigma-Aldrich | -- |
| 质谱分析 | Easy-nLC 1200液相色谱系统 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA测序 | Agilent Bioanalyzer 2100生物分析仪 | Agilent Technologies | -- |
| Qubit 3.0荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Nanodrop One分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Illumina NovaSeq 6000测序平台 | Illumina | -- | |
| Co-IP | Protein A/G磁珠 | Beyotime | -- |
| FZD7内化 | EZ-Link Sulfo-NHS-S-S-生物素 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Wnt3a蛋白 | MedChemExpress | -- | |
| 链霉亲和素磁珠 | -- | -- | |
| 抑制剂处理 | 氯丙嗪 | -- | -- |
| 巴弗洛霉素A1 | -- | -- | |
| 免疫组化 | EDTA缓冲液（pH 9.0） | ZSBion | -- |
| DAB显色剂 | -- | -- | |
| 动物实验 | BALB/c小鼠 | Vital River | -- |
| XAV-939 | MCE | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | 患者队列来源（The Fourth Hospital of Hebei Medical University），样本数量（队列1：72例，队列2：40例，队列3：12例），是否未经新辅助治疗。 阅读提示：Materials and Methods - Patient samples |
| 细胞培养 | 细胞系来源（Pricella Biotechnology），培养基（RPMI 1640或DMEM，含10% FBS），培养条件（37°C，5% CO2）。 阅读提示：Materials and Methods - Cell culture |
| circSPARC敲低/过表达 | siRNA序列（Supplementary Table 3），质粒构建（pLC5-ciR载体），转染试剂（Lipofectamine 2000），转染后培养时间（48小时）。 阅读提示：Materials and Methods - Plasmids, reagents, and antibodies; Cell transfection |
| RNA pull-down | 细胞裂解液准备，链霉亲和素磁珠（Thermo Fisher Scientific），生物素化探针浓度和孵育时间（4°C过夜）。 阅读提示：Materials and Methods - RNA pulldown assay |
| RIP实验 | 抗体（HNRNPC抗体或IgG），Magna RIP™试剂盒，细胞裂解液和孵育条件（4°C过夜）。 阅读提示：Materials and Methods - RNA immunoprecipitation (RIP) |
| RNA-seq和剪接分析 | RNA提取方法（Trizol），文库构建，测序平台（Illumina NovaSeq 6000），分析软件（rMATS），筛选阈值（FDR < 0.05, |ΔPSI| > 0.2）。 阅读提示：Materials and Methods - RNA sequencing |
| 体内模型 | 动物品系（BALB/c裸鼠），周龄（5-6周），细胞数量（皮下1×10^6，尾静脉1×10^5），观察时间（皮下5周，肺转移8周），肿瘤测量频率（每3天）。 阅读提示：Materials and Methods - In vivo tumorigenesis and metastasis formation assay |
| FZD7内化检测 | 生物素化试剂浓度（1 nM），Wnt3a处理浓度（100 ng/mL），内化时间（30分钟），剥离缓冲液成分。 阅读提示：Materials and Methods - Internalization of biotinylated FZD7 |
| Wnt信号抑制实验 | XAV-939浓度（0.2 mM），给药方式（肿瘤周围注射），给药频率（每周3次，共3周），起始时间（细胞接种后第9天）。 阅读提示：Materials and Methods - In vivo tumorigenesis and metastasis formation assay; Results - Inhibition of the Wnt/β-catenin signaling pathway abrogates circSPARC-driven ESCC progression |