鉴定CBFβ2在RORγt+ pTreg细胞分化中的作用
确定CBFβ2缺失是否影响肠道RORγt+ pTreg细胞的分化并导致结肠炎。
分析Cbfb2m/2m小鼠的肠道炎症、体重变化、结肠组织学评分，并检测小肠和大肠固有层中CD4+ T细胞的RORγt和Foxp3表达。
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Runx-CBFβ调控耐受性Thetis细胞的发育
Runx-CBFβ regulates the development of tolerogenic Thetis cells
实验完整度
高包含多种基因修饰小鼠模型（Cbfb2m/2m、Runx3突变、条件性敲除）、细胞移植实验、流式细胞术、胎儿肝脏重建及组学数据分析（scATAC-seq、ChIP-seq），并进行功能验证（pTreg分化、抗原摄取）。
主要模型
Cbfb2m/2m小鼠 Runx3+/WRPW和Runx3AID/AID小鼠 Cd11c-Cre条件性敲除Runx1/Runx3小鼠 胎儿肝脏嵌合小鼠
重点核对
Cbfb2m/2m小鼠中TC II、III、IV的缺失及RORγt+ pTreg细胞的减少 Cd11c-Cre介导的CBFβ2转基因表达恢复TC IV和RORγt+ pTreg细胞分化 Runx1/Runx3fl/fl:Cd11c-Cre小鼠中TC III和IV的显著减少，TC II保留 Rosa26lsl-tdTomato谱系追踪显示Cd11c-Cre标记大部分TC II、III和IV OVAT细胞过继转移实验显示Cbfb2m/2m受体中pTreg细胞分化受损
摘要
外周诱导的调节性T（pTreg）细胞在建立对肠道菌群和食物抗原的免疫耐受中发挥重要作用。表达RORγt的抗原呈递细胞亚群——Thetis细胞IV亚群（TC IV）在肠道耐受中起关键作用。然而，调控该亚群分化的转录因子仍不清楚。在此，我们表明Runx–CBFβ复合物调控特定TC亚群的发育。缺乏CBFβ2的小鼠表现出TC II、III和IV的缺失，以及RORγt+ pTreg细胞的丧失。通过Cd11c-Cre转基因表达CBFβ2可恢复CBFβ2缺陷小鼠中的TC IV和RORγt+ pTreg细胞分化。通过Cd11c-Cre条件性失活Runx1和Runx3选择性地损害TC III和IV。相反，Cd11c-Cre驱动的转基因Runx表达增强了TC IV分化，进而促进RORγt+ pTreg细胞的诱导。这些发现确立了TC IV分化的关键途径，并为促进自身免疫疾病中RORγt+ pTreg细胞诱导的治疗干预提供了新见解。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- Runx-CBFβ转录因子复合物是否调控RORγt+抗原呈递细胞（特别是Thetis细胞）的发育，进而影响肠道RORγt+ pTreg细胞的分化和免疫耐受？
- 核心机制
- Runx–CBFβ复合物通过调控Rorc基因座中的+11E增强子等顺式调控元件的激活，驱动TC II、III和IV亚群的发育，其中TC IV是诱导RORγt+ pTreg细胞所必需的关键耐受性APC亚群。
- 主要证据
- Cbfb2m/2m小鼠缺乏TC II-IV和RORγt+ pTreg细胞；Cd11c-Cre介导的CBFβ2或Runx转基因表达恢复TC IV并重建RORγt+ pTreg细胞分化；Runx3突变或Runx1/Runx3条件性敲除导致TC III/IV缺失；胎儿肝脏重建实验表明RorcΔ+11E/Δ+11E和RorcGFP/GFP胚胎无法重建TC。
- 研究意义
- 作者提出，通过调控Runx表达来操纵TC IV的发育，可能为炎症性肠病和食物过敏等免疫疾病提供新的治疗干预途径，以促进RORγt+ pTreg细胞的诱导。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞类型特异性挽救实验
确定CBFβ2在哪种细胞类型中发挥作用以支持RORγt+ pTreg细胞分化。
使用Rosa26lsl-Cbfb2/+等位基因和多种Cre品系（Vav1-iCre、Mb1-Cre、Cd4-Cre、Cd11c-Cre、Rorc-Cre、Il7r-Cre）在Cbfb2m/2m背景中特异性恢复CBFβ2表达，并通过流式细胞术检测RORγt+ pTreg细胞的频率。
过继转移实验评估pTreg细胞诱导
验证在CBFβ2缺陷环境中，pTreg细胞分化缺陷是否由T细胞外在因素导致。
将CD45.2+ OT-II TCR转基因小鼠的初始CD4+ T细胞过继转移到CD45.1 Cbfb+/+或Cbfb2m/2m受体小鼠，并通过口服OVA喂食诱导抗原特异性pTreg细胞分化，然后通过流式细胞术分析供体细胞的Foxp3和RORγt表达。
分析CBFβ2缺陷小鼠的TC亚群构成
确定CBFβ2缺失对特定Thetis细胞亚群发育的影响。
通过流式细胞术分析2-3周龄Cbfb+/+和Cbfb2m/2m小鼠mLN中RORγt+MHCII+细胞亚群（TC I、TC II、TC III、TC IV和ILC3/LTi）的数量，同时分析RORγt−APC区室（cDC）。
评估Runx3突变对TC发育的影响
确定Runx3功能减弱或丧失对TC亚群发育及RORγt+ pTreg细胞分化的影响。
分析Runx3+/WRPW和Runx3AID/AID小鼠的结肠炎发展、RORγt+ pTreg细胞频率、mLN中TC亚群组成以及RORγt−APC区室。
研究Rorc +11E增强子的作用
确定Rorc基因座中的+11E增强子是否是Runx-CBFβ调控TC发育的重要靶点。
分析公开的scATAC-seq数据，评估TC亚群中Rorc和Prdm16基因座的染色质可及性，并利用RorcΔ+11E/Δ+11E小鼠模型和胎儿肝脏重建实验，检测TC发育的缺陷。
验证Runx1和Runx3的功能冗余性及转基因恢复
评估Runx1和Runx3在TC发育中的功能冗余性，并测试转基因Runx表达是否能够恢复TC分化及RORγt+ pTreg细胞。
生成Runx1/Runx3fl/fl:Cd11c-Cre小鼠，并通过Rosa26lsl-Runx1或Rosa26lsl-Runx3转基因进行恢复。通过流式细胞术检测TC亚群数量、RORγt+ pTreg细胞频率及OVA-Texas Red摄取能力。
确定TC IV在RORγt+ pTreg细胞诱导中的充分性
确定恢复TC IV是否足以恢复CBFβ2缺陷小鼠中的RORγt+ pTreg细胞分化。
在Cbfb2m/2m小鼠中通过Cd11c-Cre驱动转基因CBFβ2表达，分析TC亚群的恢复情况以及RORγt+ pTreg细胞的分化，并检测恢复的TC IV是否表达PRDM16。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 基因编辑 | Alt-R S.P. Cas9核酸酶V3 | IDT | 100 ng/μl |
| Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA | IDT | -- | |
| Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA | IDT | -- | |
| 合成单链供体DNA | IDT | -- | |
| 组织处理 | IV型胶原酶 | Sigma | C-5138 |
| DNA酶 | Fujifilm | 043-26773 | |
| Percoll | -- | -- | |
| 流式细胞术 | 转录因子缓冲液套装 | BD Biosciences | 562574 |
| 可固定活力染料eFluor 506 | Invitrogen | 65-0866 | |
| 抗PRDM16抗体 | Abcam | ab303534 | |
| 山羊抗兔IgG（H+L）交叉吸附二抗，Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A21244 | |
| 免疫印迹 | EasySep小鼠CD8+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| Immobilon-P转印膜 | Millipore | -- | |
| 抗Runx3抗体（D6E2, 9647） | Cell Signaling | 9647 | |
| 抗GAPDH抗体（6C5, sc-32233） | Santa Cruz | sc-32233 | |
| ECL Prime | GE Healthcare | -- | |
| 过继转移 | EasySep小鼠CD4+ T细胞分离试剂盒 | STEMCELL Technologies | -- |
| OVA（III级） | Sigma | A5378 | |
| 抗原摄取 | Texas Red偶联OVA | Invitrogen | O23021 |
| 流式细胞术 | BD FACSCanto II | BD Biosciences | -- |
| BD FACSAria Fusion | BD Biosciences | -- | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | -- | |
| FlowJo软件 | BD Biosciences | -- | |
| 统计分析 | GraphPad Prism（v8.4.3） | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 小鼠品系：Cbfb2m/2m、Runx3+/WRPW、Runx3AID/AID、Runx1fl/fl、Runx3fl/fl、Cd11c-Cre、Vav1-iCre、Il7r-Cre、Rorc-Cre、Rosa26lsl-Cbfb2、Rosa26lsl-Runx1、Rosa26lsl-Runx3、OT-II、RorcGFP等；饲养环境：SPF；年龄：2-14周。 阅读提示：Methods-小鼠 |
| 结肠炎评估 | 结肠组织学评分方法（参考Erben et al.）；小鼠年龄：8-12周（Cbfb2m/2m）或3个月（Runx3突变）；样本量（例如n=4-7）。 阅读提示：Methods-组织学；图1a、图3a、扩展数据图3d/e |
| 组织处理 | 肠道固有层淋巴细胞分离步骤（EDTA、胶原酶IV、DNase、Percoll梯度）；mLN处理步骤。 阅读提示：Methods-组织处理 |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号（如B220 (RA3-6B2)、CCR6 (29-2L17)、CD11c (N418)、RORγt (B2D、Q31-378)、Foxp3 (FJK-16s)等）；固定/透化缓冲液（BD Transcription Factor Buffer Set）；死活染料（Fixable Viability Dye eFluor 506）；仪器和软件。 阅读提示：Methods-流式细胞术 |
| 过继转移实验 | 分选的初始OT-II T细胞纯度（>99%）；转移细胞数（5×10^4）；受体小鼠周龄（P21）；OVA给药方案（第1天和第3天口服25mg OVA，外加0.75% OVA饮用水）；分析时间点（转移后1周）。 阅读提示：Methods-过继性OT-II T细胞转移；图1d |
| 胎儿肝脏重建 | 胎肝供体胚胎日龄（E14.5）；供体CD45.2；受体CD45.1；亚致死剂量照射；分析时间点（2-3周后）。 阅读提示：Methods-胎儿肝脏转移；图4d |
| 抗原摄取实验 | 小鼠周龄：P14-21；Texas Red-OVA浓度：20 mg/ml；灌胃体积：200 μl；等待时间：16小时；分析mLN。 阅读提示：Methods-口服灌胃和抗原摄取；图5e/f |