单核RNA测序分析配对原发和复发肿瘤
识别原发和复发AT/RT在转录组水平的差异，并区分肿瘤细胞和TME细胞。
对8对原发和复发AT/RT样本进行snRNAseq，通过CNV和标记基因分离肿瘤细胞和TME，并进行差异丰度分析、细胞通讯推断和聚类分析。
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AT/RT进展过程中与上皮间质转化和细胞外基质变化相关的分子改变
Molecular changes during AT/RT progression associated with epithelial-mesenchymal transition and extracellular matrix changes
实验完整度
高包含snRNAseq分析、IHC验证、体外细胞实验（耐药模型和药物抑制）及生存分析等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
人AT/RT肿瘤样本（8对原发和复发） AT/RT-MYC细胞系BT-16和CHLA-266 AT/RT-MYC患者队列（bulk RNAseq）
重点核对
snRNAseq分析中，肿瘤细胞与TME的分离依据CNV和标记基因 CIBERSORT分析中，原发肿瘤细胞簇与复发肿瘤细胞簇的相似性（CLUSTERS 2,4,5） 体外耐药细胞模型：doxorubicin (1 µM)、etoposide (5 µM)、vincristine (1 µM) 连续处理，约35天耐药细胞再生长 ETS1抑制剂TK216 (1 µM) 联合化疗对细胞活力的影响 生存分析中基因签名分组的最优截断值（maxstat）
摘要
非典型畸胎样/横纹肌样瘤（AT/RT）是婴儿期最常见的恶性脑肿瘤，预后极差。大多数患者会出现肿瘤进展或复发，但潜在机制尚不清楚。为了更好地理解这些机制，我们对8对原发肿瘤和复发肿瘤进行了单核RNA测序（snRNAseq）。分别分析了肿瘤细胞和肿瘤微环境（TME）细胞。通过使用CIBERSORT比较原发和复发肿瘤细胞群体的整体基因表达谱，鉴定出潜在的治疗耐药性肿瘤细胞。进行了组织病理学、体外实验、批量RNA测序和生存分析进行验证。配对的原发和复发AT/RT在基因表达谱上显示出显著差异。潜在治疗耐药性AT/RT-MYC肿瘤细胞显示出细胞外基质（ECM）的变化以及发育过程和免疫信号通路的改变。相应的基因特征与AT/RT-MYC患者较差的生存期相关。复发的AT/RT-MYC肿瘤细胞经历了部分上皮间质转化（pEMT），这一特征通过免疫组织化学（IHC）和分析标准治疗后体外的AT/RT细胞得到了证实。总之，我们确定了AT/RT肿瘤复发和治疗耐药的潜在机制，这些机制可用于改善未来的治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- AT/RT肿瘤进展和复发的潜在机制是什么？特别是治疗耐药性肿瘤细胞的特征。
- 核心机制
- AT/RT-MYC复发肿瘤细胞发生部分上皮间质转化（pEMT），伴随细胞外基质（ECM）重塑和免疫信号通路改变，可能促进治疗耐药和肿瘤复发。
- 主要证据
- snRNAseq分析显示复发肿瘤细胞中pEMT比例增加，IHC证实EMA表达降低，体外化疗处理细胞系后pEMT标志基因上调，ETS1抑制剂TK216降低耐药细胞活力。
- 研究意义
- 研究揭示了AT/RT治疗耐药的潜在机制，为开发新的治疗策略提供了靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
鉴定潜在治疗耐药性肿瘤细胞
通过比较原发和复发肿瘤细胞的基因表达谱，识别可能对治疗耐药的细胞亚群。
使用CIBERSORT对AT/RT-MYC原发和复发肿瘤细胞簇进行相似性分析，将原发肿瘤簇2、4、5定义为潜在治疗耐药细胞。
体外化疗耐药模型验证
验证标准治疗是否能诱导AT/RT-MYC细胞发生pEMT和上调耐药相关基因。
用doxorubicin、etoposide和vincristine处理BT-16和CHLA-266细胞系，诱导耐药细胞，通过IHC和bulk RNAseq检测pEMT标志物和耐药基因表达。
ETS1抑制剂TK216功能验证
探究抑制ETS1能否降低治疗耐药性。
在化疗基础上加入ETS1抑制剂TK216，用CellTiter-Glo检测细胞活力，比较有无TK216的耐药细胞生长情况。
生存分析
评估耐药相关基因表达与AT/RT-MYC患者生存的相关性。
基于bulk RNAseq数据，将患者分为高表达和低表达耐药相关基因（137个上调基因）两组，进行Kaplan-Meier生存分析和多变量Cox回归分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 单核RNA测序 | Chromium单细胞Flex基因表达试剂盒 | 10x Genomics | -- |
| gentleMACS Octo组织解离器 | Miltenyi Biotec | 130-134-029 | |
| Liberase TH | Millipore Sigma | 5401151001 | |
| Chromium固定RNA分析试剂盒 | 10x Genomics | PN-1000414 | |
| NextSeq 2000测序仪 | Illumina | -- | |
| NovaSeq 6000测序仪 | Illumina | -- | |
| 细胞培养 | BT-16细胞系 | -- | -- |
| CHLA-266细胞系 | -- | -- | |
| 药物处理 | 阿霉素 | -- | -- |
| 依托泊苷 | -- | -- | |
| 长春新碱 | -- | -- | |
| TK216 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CellTiter-Glo发光细胞活力检测试剂盒 | Promega | G7570 |
| Tecan Infinite M200酶标仪 | Tecan Group AG | -- | |
| 免疫组织化学 | 抗EMA/粘蛋白-1抗体 | DAKO | M0613 |
| 抗CD1A抗体 | Novocastra | NCL-L-CD1a-235 | |
| 抗Langerin抗体 | Cell Marque™ | 12D6, | |
| Ventana染色系统 | Roche | -- | |
| 批量RNA测序 | Qubit 4荧光计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SMART-Seq链特异性试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| NovaSeq X Plus测序仪 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单核RNA测序 | FFPE组织样本处理，单核悬液制备，测序平台和试剂盒 阅读提示：Methods: Data sets, Isolation of cells from FFPE tissue and snRNAseq |
| 鉴定潜在治疗耐药细胞 | CIBERSORT分析中使用的细胞簇划分、相似性阈值和统计方法 阅读提示：Methods: CIBERSORT analysis, Fig. 2h |
| 体外化疗耐药模型 | 药物处理浓度和时间：1µM doxo, 5µM eto, 1µM vin连续三天；耐药细胞生长时间约35天 阅读提示：Methods: Cell culture, Fig. 4d |
| ETS1抑制剂功能验证 | TK216浓度（1 µM）及处理时间（56天），细胞活力检测方法和对照设置 阅读提示：Methods: Cell culture, Fig. 4g |
| 生存分析 | 患者队列纳入标准、基因分组阈值（137个基因）和统计模型（Log-Rank检验、Cox回归） 阅读提示：Methods: Survival analysis, Fig. 5 |